【Autophagy】神智之蚀！浙江大学周舟研究组揭示TMT诱导神经毒性的分子机制！

三甲基氯化锡（TMT）是一种有机合成试剂，可用于制备其他有机锡化合物。在工业和农业领域，TMT常见于杀菌剂和塑料稳定剂的组成成分[1]。生活环境中，TMT亦被发现存在于食品、饮料及家居用品之中，成为威胁人类健康的重要有害环境因素。

三甲基氯化锡（TMT）

图片来源：chemsrc.com

在过去几十年里，TMT被发现具有神经毒性[2, 3]。中毒的早期症状是身体乏力，伴随阵发性头痛、耳鸣、记忆障碍。重度中毒者可出现幻觉、躁狂及行为异常，甚至昏迷、死亡。TMT可在人类及啮齿类动物大脑中特异性诱导神经损伤，在海马体尤为明显[4]。因此，探究TMT产生神经毒性的分子机制，对临床治疗相关神经疾病意义重大。

图片来源：Wikipedia

自噬（Autophagy），是一种高度保守的过程，对细胞内累积蛋白和受损细胞器的清除至关重要[5]。近期研究发现，TMT可破坏多种原代神经细胞的自噬流，其中包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞[6-8]。这些结果表明，自噬过程受损可能参与TMT诱导神经毒性过程。

细胞自噬过程

图片来源：Current Biology [9]

2020年3月11日，《Autophagy》杂志在线刊登了浙江大学医学院周舟研究组的最新重要工作[10]，他们发现TMT作用于分子马达KIF5A以破坏细胞自噬流，进而引起神经毒性。细胞中以及小鼠在体过表达KIF5A可缓解TMT诱导的神经毒性。该研究首次发现TMT诱导神经毒性的分子机制，极大提高了人们在神经毒性领域的认知。

周舟教授

图片来源：浙江大学

结果

01

TMT破坏Neuro-2a细胞内自噬流以诱导神经毒性

首先，作者使用TMT作用于Neuro-2a细胞，并通过蛋白质组分析其神经毒性的潜在诱因。他们发现，自噬相关蛋白质在TMT作用后表达水平显著改变，表明自噬参与TMT诱导神经毒性这一过程。

为验证上述假设，作者探究TMT对细胞内自噬流的影响。在自噬过程中，LC3B-I被处理，LC3B-II表达水平与自噬体数量呈正相关，因此LC3B-II与LC3B-I的比值（LC3B-II:LC3B-I）常用于表征自噬活性[11]。他们发现，TMT处理增加Neuro-2a细胞内LC3B-II:LC3B-I（图1A），表明TMT引起胞内自噬体累积。

过去研究表明，自噬是一种高动态过程，过强的自噬诱导水平与降低的自噬体转化水平均可引起自噬体累积[12]。SQXTM1与LC3B-II结合，自噬的抑制作用与SQXTM1表达水平的上调密切相关[12]。作者发现，TMT处理增加Neuro-2a细胞内SQXTM1的表达水平（图1B），表明自噬过程受到抑制。

另有研究发现，氯喹（CQ）可以阻止自噬体与溶酶体结合以抑制细胞自噬[13]。若诱导自噬过程，CQ共处理可上调LC3B-II表达水平；若抑制自噬过程，CQ共处理不影响LC3B-II表达水平。作者发现，CQ共处理条件下，TMT引起的胞内LC3B-II的累积水平不再有进一步提高（图1C-D），进一步表明自噬过程受到TMT抑制。

这些结果提示，TMT是一种潜在的自噬抑制剂而非活化剂。

图1  TMT破坏Neuro-2a细胞内自噬流以诱导神经毒性

02

 TMT抑制Neuro-2a细胞溶酶体功能

由于自噬是一个多步过程，作者进一步探究TMT作用于自噬的哪一阶段。他们通过 siRNA下调Neuro-2a细胞内ATG5表达水平、自噬抑制剂3-MA作用、GFP-LC3B与LAMP2共定位检测等方法，发现TMT并不参与吞噬泡形成、自噬体成熟与自噬体-溶酶体融合过程。

接着，为探究TMT是否抑制溶酶体功能，作者检测Neuro-2a细胞内溶酶体膜表面LAMP1和LAMP2的表达水平。他们发现，TMT处理上调LAMP1而非LAMP2的表达水平（图2A-B）。他们还发现，TMT处理后，细胞内蛋白质水解活性显著降低（图2C），LysoSensor DND-189荧光强度亦显著减弱（图2D）。以上结果显示，TMT可抑制Neuro-2a细胞溶酶体功能，进而破坏其自噬流。

图2  TMT抑制Neuro-2a细胞溶酶体功能

03

Neuro-2a细胞内过表达KIF5A抑制TMT诱导的自噬流破坏过程

然后，为探究TMT破坏Neuro-2a细胞内自噬流的分子机制，作者通过IPA分析分子作用网络。IPA和WB结果提示，KIF5A很可能是TMT破坏自噬流的关键因子。

为进一步证实上述假设，作者在Neuro-2a细胞中过表达KIF5A。和预期一致，过表达KIF5A显著增强TMT处理后Neuro-2a细胞的生存能力（图3A），蛋白质水解活性和LysoSensor DND-189荧光强度亦显著增加（图3B-C）。而且，过表达KIF5A后，Neuro-2a细胞内LC3B-II和SQSTM1的表达水平显著下调（图3D-E）。以上结果表明，过表达KIF5A通过维持自噬流以保护细胞免受TMT诱导的神经毒性。

图3  Neuro-2a细胞内过表达KIF5A抑制TMT诱导的自噬流破坏过程

04

原代海马神经元内过表达KIF5A恢复轴突运输作用

再然后，作者探究KIF5A在神经元中的功能。他们使用TMT处理原代海马神经元，发现神经元内KIF5A表达水平显著下调（图4A）。过去研究显示，KIF5A是一种微管依赖性分子马达，在哺乳动物中枢神经系统神经元中运输溶酶体等多种物质[14]。因此，作者在原代海马神经元中检测溶酶体的轴突运输作用。他们发现，TMT处理后原代海马神经元顺行运输速率显著降低，溶酶体运输效率也显著下降。而通过ADV-Kif5a在原代海马神经元内过表达KIF5A后，神经元顺行运输速率和溶酶体运输效率均恢复至正常水平（图4B-E），表明依赖于KIF5A的轴突运输缺陷可能是TMT破坏自噬流的诱因。

图4  原代海马神经元内过表达KIF5A恢复轴突运输作用

05

TMT通过下调小鼠海马KIF5A表达水平以破坏细胞自噬过程

离体实验之后，作者通过在体实验进一步探究KIF5A在TMT破坏自噬流过程中的功能。他们在小鼠腹腔内注射TMT，发现小鼠产生癫痫现象，小鼠海马体大量神经元缺失。他们还发现，海马体中LC3B-II表达水平显著上调，KIF5A表达水平显著下调；而LAMP1、LAMP2、ATP6V1E1、ATP6V0D1表达水平无明显变化，溶酶体内酸碱度亦无变化（图5A-G），表明小鼠海马体细胞自噬过程受损。此外，CTSB活性显著下调，而CTSD活性无明显变化（图5H-I），表明溶酶体蛋白酶活性受损。

图5  TMT通过下调小鼠海马KIF5A表达水平以破坏细胞自噬过程

06

在体过表达KIF5A恢复海马自噬流以缓解TMT诱导的神经毒性

最后，作者探究在体过表达KIF5A能否保护神经元免受TMT诱导的神经毒性。他们在小鼠的尾静脉中注射AAV PHP.eB-Kif5a以全身过表达KIF5A。他们发现TMT处理后，小鼠海马内KIF5A表达水平与正常小鼠相仿，海马损伤显著减少，癫痫症状亦显著减轻（图6A-D）。他们还发现，过表达KIF5A可减少海马中LC3B-II的累积，也可增加CTSB活性（图6E-F）。

综上，在体过表达KIF5A可通过恢复自噬流以减轻TMT诱导的海马神经毒性。

图6  在体过表达KIF5A恢复海马自噬流以缓解TMT诱导的神经毒性

总结

生活环境中，TMT存在于食品、饮料及家居用品中，具有神经毒性。而有关TMT诱导神经毒性的分子机制，我们知之甚少。本篇文章结合细胞实验、在体实验以及基于AAV PHP.eB的基因过表达方法，发现细胞、神经元或在体实验中，TMT可通过KIF5A抑制Neuro-2a细胞溶酶体功能，破坏其自噬流，进而诱导神经毒性。此外，细胞、在体过表达KIF5A恢复自噬流并缓解TMT诱导的神经毒性。这项研究阐释了TMT破坏自噬流以诱导神经毒性的分子机制（图7），为临床治疗TMT诱发的癫痫提供药物靶点！

图7  TMT诱导神经毒性的示意图

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参考文献

1.Boyer, I.J., Toxicity of dibutyltin, tributyltin and other organotin compounds to humans and to experimental animals. Toxicology, 1989. 55(3): p. 253-298.

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3.Yoo, C.I., et al., A Case of Acute Organotin Poisoning. Journal of Occupational Health, 2007. 49(4): p. 305-310.

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7.Fabrizi, C., et al., Impairment of the autophagic flux in astrocytes intoxicated by trimethyltin. NeuroToxicology, 2016. 52: p. 12-22.

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10. Liu, M., et al., KIF5A-dependent axonal transport deficiency disrupts autophagic flux in trimethyltin chloride-induced neurotoxicity. Autophagy, 2020: p. null-null.

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