PPR技术----基因编辑技术的下一场革命?

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细胞与基因治疗领域

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三角状五肽重复（Pentatricopeptide repeat，PPR）技术专利持有公司-EditForce2022年7月宣布将从田边三菱制药获得预付款与阶段性付款总额达200亿日元（约1.46亿美元）的资金，以通过其PPR蛋白技术进行药物研发¹。Editforce的PPR蛋白平台是基于Takahiro Nakamura和Yusuke Yagi博士(Editforce的CTO)的工作，他们发现了PPR蛋白决定序列特异性的机制，并开发了创建定制PPR蛋白结合特定目标DNA或RNA序列的技术。这些经过工程改造的PPR蛋白可以与效应蛋白融合，从而在细胞内外修改目标DNA或RNA。Editforce先期目标将针对中枢神经系统（CNS）领域内的特定靶标疾病进行潜在基因疗法的研究、开发与商业化。作为一种新型的基因编辑技术，本文将对PPR技术及其应用进行简要介绍。

1.PPR技术的起源

2000年左右，在法国的两个独立研究小组首次发现PPR蛋白后不久，Editforce创始人Takahiro Nakamura，开始着手对PPR蛋白的研究。他在以色列做博士后时发现一种来自杂草芥菜植物的蛋白，含有数千个PPR基序，每个基序大约有35个氨基酸长，每个基序都是维持该蛋白在叶绿体中与RNA结合所必须的。在九州大学，Takahiro Nakamura继续对PPR蛋白进行研究，以确定在PPR中是哪些特定的氨基酸介导了其对目标RNA的特异性和亲和力。2013年，他和Yusuke Yagi博士终于破译了PPR蛋白质识别特定RNA序列的分子密码——这一发现使定制PPR蛋白结合RNA成为可能，定制的PPR蛋白原则上可以结合细胞中任何位置的RNA。在对PPR技术进行优化以进行DNA编辑后，Takahiro Nakamura为PRR技术申请了基础知识产权(IP)专利，并于2015年成立了EditForce，由行业资深人士Takashi Ono担任公司总裁兼首席执行官。Takashi Ono和他的团队希望将EditForce打造成全球基因组编辑市场的主要参与者，分析师预测到2025年该市场的价值可能高达100亿美元²。

2.PPR蛋白

PPR蛋白广泛存在于真核生物中，在陆生植物中尤为普遍，PPR蛋白大多定位于线粒体或叶绿体，是可与特定RNA结合的核酸结合蛋白；PPR蛋白功能缺陷导致植物生长发育异常，甚至胚胎致死。除在植物中，人和酵母同样发现PPR家族基因（图1），这些基因编码的PPR蛋白被称为“序列特异性RNA结合蛋白”，所有PPR家族成员都可与不同的RNA分子结合，其结合率可达1nm（KD值）。PPR与RNA结合后可促进RNA正确折叠，保护RNA以防被体内RNA酶降解。除此之外，某些PPR蛋白还具有酶结构域，并且能够进行位置特异性RNA切割和碱基置换³。

图1.PPR蛋白在不同物种的分类³

PPR蛋白作为植物中最大的核编码螺旋重复蛋白家族之，其最早由Small和peters在拟南芥核基因组中发现。PPR蛋白由数量不定的PPR基序的串联重复序列组成，每个序列约由35个氨基酸组成；大多数PPR蛋白被预测定位在叶绿体或线粒体中。PPR蛋白只存在于真核生物中，PPR家族成员多少在不同物种之间有较大差异。例如，在被子植物中PPR基因超过400，在拟南芥和水稻中分别有超过400个PPR和477个PPR基因已被确认。与高等植物相比，包括人类、果蝇、原生生物和藻类在内的所有其他真核生物都含有种数较少的PPR蛋白，这表明在植物进化过程中，这些蛋白的数量急剧增加。由于PPR蛋白家族在生理和生物发育，以及包括RNA剪接、RNA切割、翻译和RNA稳定等细胞器和质体RNA代谢方面的独特作用，使许多研究者重新点燃了对该家族在植物中的研究兴趣。一般来说，PPR蛋白通过RNA编辑或参与RNA稳定和剪接进而调节植物的生长发育。所有PPR蛋白都包含2~30个串联重复的序列基序（PPR基序），每个PPR基序含35个氨基酸，可形成螺旋-环-螺旋。Takahiro Nakamura等发现一个PPR基序能够识别一个碱基，且识别的特异性取决于该基序上特定三个位置的氨基酸序列⁴。如果将20个PPR基序连接成一个PPR蛋白，就可以与特定的20个碱基序列结合结构。PPR基序的氨基酸组合与其碱基特异性识别的关系如图2。目前的PPR技术不仅可以识别RNA，也可识别DNA；其对DNA碱基的识别规则与RNA相同⁵。

图2.一个PPR基序可以与一个碱基结合，而其所能结合的碱基类型是由PPR基序中三个特定位点（1,4和ii）的氨基酸序列组合决定⁶。

3.PPR技术的应用

人体由37万亿个细胞组成，DNA储存在细胞核中。DNA编辑可为人遗传性遗传疾病的治疗提供终极解决方案。在人从婴儿到老年人的一生中，DNA不会发生显著变化；我们人身体各组织器官的DNA是相同的。影响我们身体时空变化的一个重要因素是DNA产生了什么样的RNA。在人类现有疾病中，有超过15%的疾病和RNA的功能异常相关；此外，在人体中已经观察到大量的非编码RNA表达，其功能失调将导致人体生长发育等环节异常。因此，基于PPR 的DNA/RNA编辑，将为DNA/RNA的条件控制提供新的方法。目前，EditForce已经在尝试将可与DNA结合的PPR技术应用于癌症患者的CAR-T治疗；通过于Japan Innovative Therapeutics制药公司合作，EditForce正在设计靶向目标RNA的PPR蛋白，旨在纠正导致老年性黄斑变性的基因表达失衡²。

在人类细胞和小鼠模型中，研究人员已经表明，他们可以设计出特异性PPR蛋白，矫正由RNA剪接异常导致的眼睛和神经系统疾病。研究人员还通过改造PPR蛋白，以引导RNA转录本的细胞定位，进而提高细胞RNA的翻译效率²。与CRISPR/Cas相似，PPR蛋白也可通过融合不同的效应分子，实现不同的细胞内应用如图3所示。

图3.PPR技术的应用。（1）调节RNA结构及剪切。（2）影响RNA稳定性。（3）通过和核酸酶或核苷酸脱氨酶形成融合蛋白对核酸序列进行切割或实现碱基编辑。（4）基因的转录和翻译调控。（5）基因表观遗传学调控。（6）基因或RNA的细胞成像。（7）RNA定位²。

4.PPR与CRISPR比较

与CRISPR技术相比，PPR技术显然并未获得媒体的广泛关注。与大多数CRISPR系统只针对DNA不同，基于PPR的工具可同时对DNA或RNA进行精确编辑。另外，PPR蛋白的大小要小于CRISPR系统，因此更适合体内递送；除此之外，与CRISPR系统的细胞核定位不同，PPR蛋白还可以通过连接信号肽而定位与线粒体，实现线粒体编辑；最后，由于PPR技术的碱基靶向性依赖于PPR基序，与依赖于引导RNA（sgRNA）的CRISPR技术相比，其可能具有更高的稳定性。因此，PPR具备成为下一代基因编辑技术的潜力。然而，PPR依然属于新生技术，其基因编辑效率、脱靶性和细胞毒性等依然并未阐明，有待进一步深入研究。另外，与CRISPR相比，编码PPR基序的碱基序列较sgRNA长，因此序列合成难度和成本会相应升高。

5.结语

ZFN、TALEN和CRISPR/Cas作为基因编辑的三大利器已被应用于生命医学中的各个方面如细胞动物模型构建、基因治疗和转基因，但这三种技术各有优缺点（表1），因此在实际操作中需要根据具体要求做合适选择⁷。PPR技术作为另一种新兴基因编辑技术，其成功有望提供基因改造的另一种选择。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas分别来源于非洲爪蟾转录研究、黄单胞菌侵染植物和细菌免疫系统研究^8-10；PPR技术来源于植物线粒体功能研究，而最近DavidLiu 和Jin-SooKim开发的线粒体碱基编辑器其核心元件—脱氨酶毒素DddA来源于细菌毒素^11,12；上述发现提示我们在高等动物中由基因异常导致的疾病可能会在低等生物中寻找到答案。因此随着对多物种生命活动的深入研究，可能有新的可用于哺乳动物的基因编辑器被开发。

表1.ZFN、TALEN和CRISPR/Cas三种基因编辑工具特性

	ZFN	TALEN	CRISPR/Cas
碱基识别	锌指结构	可变双残基重复	sgRNA
靶点	预测性差	预测性差	预测性高
引导分子	两个锌指结构对应一个靶序列	两个TALEN结构对应一个靶序列	一个sgRNA对应一个靶序列
多靶点	困难	困难	较容易
可行性	一般大型公司有能力开展，成本高	耗时但成本可接受	易操作且成本低

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6.参考文献

（可上下滑动查看）

1.https://www.editforce.co.jp/en/news-en/release-en/2022/1027/

2.https://www.nature.com/articles/d42473-019-00327-w

3.https://www.editforce.co.jp/en/ppr/

4.Imai T, Yagi Y, Nakamura T. Recent Progress Toward RNA Manipulation with Engineered Pentatricopeptide Repeat Proteins in Applied RNA Bioscience (editors: Masuda S, Izawa S) pp. 151-160 (Springer, Singapore, 2018).

5.Kobayashi T, Yagi Y, Nakamura T. Development of genome dngineering tools from plant-specific PPR proteins using animal cultured cells. Methods Mol Biol 1469, 147-155 (2016).

6.https://www.editforce.co.jp/en/ppr/

7.Eid, A., Mahfouz, M. Genome editing: the road of CRISPR/Cas9 from bench to clinic. Exp Mol Med 48, e265 (2016). https://doi.org/10.1038/emm.2016.111

8.Hillary, V. E., & Ceasar, S. A. (2021). Genome engineering in insects for the control of vector borne diseases. Progress in Molecular Biology and Translational Science, 179, 197-223.

9.Cermak, T., Doyle, E. L., Christian, M., Wang, L., Zhang, Y., Schmidt, C., ... & Voytas, D. F. (2011). Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic acids research, 39(12), e82-e82.

10.Garneau, J. E., Dupuis, M. È., Villion, M., Romero, D. A., Barrangou, R., Boyaval, P., ... & Moineau, S. (2010). The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature, 468(7320), 67-71.

11.Mok, B. Y., de Moraes, M. H., Zeng, J., Bosch, D. E., Kotrys, A. V., Raguram, A., ... & Liu, D. R. (2020). A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature, 583(7817), 631-637.

12.Cho, S. I., Lee, S., Mok, Y. G., Lim, K., Lee, J., Lee, J. M., ... & Kim, J. S. (2022). Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell, 185(10), 1764-1776.

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