iPSCs的应用以及挑战
图一：OSKM（Oct4、Sox2、Klf4 、c-Myc） 转录因子的作用
iPSC的发现为再生医学带来了新视角和福音，通过iPSC技术，可以重编程成体细胞，诱导其分化成干细胞、神经元或其他任何细胞，最终用于疾病的治疗、组织的修复。而且个性化的iPSCs技术降低了免疫排斥的风险，同时也绕开了使用胚胎干细胞引发的伦理道德问题。
图二：iPSCs 衍生概述示意图（DOI: 10.1089/ars.2010.3814）
根据iPSCs重编程所应用的载体不同，现有的iPSC的诱导方法分为以下几类。
1. 整合病毒载体转移系统
整合病毒将 DNA 插 入宿主的染色体內，有可能导致宿主基因表达的异常，得到的iPSCs不稳定，并且存在致癌的可能。
逆转录病毒。最初应用的载体，已被广泛用作体外和体内研究的基因转移载体。
慢病毒载体。因其广泛的亲和性被用来重编程多种体细胞，重编程效率为 0.1%~1%，是目前最有效的重编程策略之一。
与整合病毒转移系统相比，非病毒转移系统，如质粒、转座子等更安全。
质粒。第一个成功的非病毒性 iPSCs 是由成熟的胚胎成纤维细胞经两个质粒载体转染产生的，但整合风险和重编程效率低下是主要问题。 转座子（PiggyBac（PB）系统& Sleeping Beauty(SB)系统）。PB整合到细胞中后，该元件的残余可以从iPSCs中去除，但是人类基因组中有内源性的类 PB 转座子元件，在转基因切除后会引起非特异性的基因组改变。
为克服 PB的局限，人们又引入了SB系统，SB转座子整合频率低，人类基因组中也没有类 SB 元件。但是SB也面临着重编程效率低以及整合风险的问题。
3. 非整合病毒载体转移系统
腺病毒。利用腺病毒建立的人和小鼠 iPSCs，在宿主基因组中没有外源性 DNA 插入，但其重编程效率仅限于 0.001%。尽管如此， 腺病毒方法在转化医学中的应用仍有很大的前景。 仙台病毒（Se-V）。Se-V可以有效地在多种类型的细胞和组织中导入外源基因，但同样遇到了重编程效率低的问题。尽管如此，人们仍在努力改良 Se-V，因为 Se-V 在囊性纤维化基因治疗和艾滋病疫苗方面具有巨大的潜力，希望可用于人 iPSCs 的细胞替代疗法。
4. 非整合非病毒载体转移系统
研究人员还使用mRNA、附加型载体等非病毒载体系统，将多潜能标记基因直接、瞬时地传递到体细胞中。这些方法相对容易使用，但重编程效率比 LV 低 5~10 倍。
附加型质粒（episomal vector）。附加型质粒包含Epstein-Barr病毒衍生的oriP/EBNA1病毒元件，这一元件可促进游离质粒DNA在分裂细胞中的复制，可允许重编程因子长时间表达以启动重编程过程，质粒最终会从增殖细胞中丢失。 mRNA。编码重编程因子的mRNA也可以诱导体细胞向iPSCs的转分化。由于mRNA的不稳定性，在细胞内会快速降解，需要每天转染诱导，这极大增加了总体工作量，但同时也说明mRNA的重编程方法比其他经典方法更安全。
iPSCs技术的出现是生物医药领域的突破，同时在体外疾病建模、毒理学研究、药物开发、个性化药物等多项关键的体外研究领域也大放异彩。
图三：来源于 iPSCs 的特定细胞和类器官在疾病建模、药物发现和细胞治疗中的应用（DOI：10.16288/j.yczz.20-235）
1. 疾病模型
iPSCs在许多疾病的分子机制研究中具有重要价值，已经广泛应用于各种疾病的疾病建模和基因治疗。与动物模型(如大鼠、小鼠、猴子、狗和灵长类动物)相比，iPSCs衍生的疾病模型更具优势，可以完全模拟人类细胞的微环境，克服不同物种之间基因差异的挑战。
器官芯片（Organs-on-chips，OOC）是一种微流控细胞培养系统，植入了患者特定的iPSC衍生的表型细胞，这些细胞作为人体器官的功能单元，具有可控的动态条件，再现了人体组织的复杂组织结构和物理化学微环境。OOC可用于开发更具有生理相关性、成本效益高的体外模型，用于hit-to-lead和lead优化，可以更可靠地预测药物在人体中的疗效、毒性和药代动力学。
2. 基于iPSCs的药物发现平台
iPSCs不仅可以衍生出与任何临床相关的表型细胞，用于高通量检测；还可以从任何患者和健康受试者中提取。因此，作为更可靠的体外人类疾病模型，iPSCs在加速药物发现和个性化精准用药方面得到了广泛的欢迎。
3. 预测药物安全性研究
目前毒理学试验最常用的细胞模型与动物模型存在很多壁垒。其中肿瘤来源的永生细胞系，经多次传代和长时间培养后会产生固有的染色体缺陷和遗传畸变。而原代培养的体细胞因批次间差异，难以获得一致和可重复的数据。而活体动物模型也有很多壁垒，比如：特定条件下动物模型是否适用于人体生理学研究；测试某些药物或者成分时的伦理问题；动物实验的高成本等。
基于iPSCs的疾病建模有极大的吸引力。一，可以从健康组织中获得，二，有大量生理相关表型的iPSCs，可用于高通量药物筛选、自动化毒理学筛选和效价测试平台，以具有成本效益的方式获得更可靠的生理数据。
4. 基于iPSCs的细胞疗法
iPSC技术推动了细胞疗法的发展。2014年，日本首次启动了用自体iPSCs来源的视网膜色素上皮细胞治疗老年性黄斑生成(AMD)的临床试验。iPSCs细胞疗法被认为是一种可以改善（因衰老）而退化的器官功能的新方法，在多种疾病中已经显示了广阔的应用前景。
（1）缺血性心肌病
日本进行了大量iPSCs临床试验。Kawamura等人将iPSCs来源的心肌细胞移植到猪缺血性心肌病模型中，显著地改善的心脏功能；京都大学开发出了用iPSCs制造的血小板技术，并通过动物实验确认了制造出来的血小板具有止血功能；大阪大学在2020年第一次为患者移植了用iPSCs培育出的心肌细胞膜片。
（2）帕金森症（PD）
日本从iPSCs中获得多巴胺前体，并在大鼠模型中证实了它们的有效性。2018年，日本京都大学团队获批首个使用iPSCs治疗PD的临床试验，该试验招募中度PD患者，使用同种异体的由iPSCc产生多巴胺能前体细胞，然后通过特殊装置将其手术移植到患者的大脑中，同时给予免疫抑制剂药物以避免免疫排斥反应。该研究最早在2023年有望接受日本再生药物的快速审批流程。
（3）自然杀伤细胞
从历史上看，人们采用了各种策略来征服癌症。2016年，iPSCs衍生的自然杀伤细胞(NK)在动物模型中被证明对卵巢癌有疗效。明尼苏达大学和Fate Therapeutics的研究人员已经获得了US-FDA批准，进行iPSCs衍生NK细胞进行临床试验，并正在验证其对各种癌症的疗效。2021年底，日本也启动了iPSCs-NK细胞治疗卵巢癌的临床实验。
（4）移植物抗宿主病GvHD
Cynata Therapeutics公司获批启动同种异体iPSCs衍生的间充质细胞（CYP001）治疗GvHD的首个临床试验。这一试验达到了所有的临床终点，为治疗急性GvDH提供了积极的安全性和有效性数据。
在过去的十几年间，iPSC产业不断地缔造医学奇迹，但是iPSCs的应用仍处在早期阶段。阻碍iPSCs技术向临床转化的因素主要来自两个方面，一方面来自其制备环节，二来自iPSCs固有的一些特性所带来的安全性问题。
1. iPSCs的来源
首先iPSCs的细胞来源就埋下了伏笔。有研究显示，iPSC会保留其来源的体细胞记忆，其残留的表观遗传记忆可能会影响iPSC表型和移植结果。其次，如前所述，整合型载体（如逆转录病毒和慢病毒）的应用会导致肿瘤抑制基因插入失活和/或致癌基因插入激活，从而改变重编程因子的构成性表达，并会改变iPSCs特征及其分化潜能。
2. iPSCs的致瘤性
未分化iPSCs的潜在致瘤风险一直是iPSCs细胞替代治疗的主要障碍之一。移植未分化的iPSCs可能会形成畸胎瘤、神经母细胞瘤等恶性肿瘤。另外鉴于肿瘤抑制基因如p53会阻碍OSKM等核心多能因子重编程过程，需要在重编程早期沉默p53。然而，这可能会导致iPSC内的基因组不稳定，最终导致肿瘤的发生。再次iPSCs在长时间培养过程中积累的异常表观遗传修饰也增加了其致瘤潜能的风险。
图四：多能性基因和P53在iPSC重编程和肿瘤形成中的不利影响（DOI: 10.1007/s12015-020-10042-5 ）
3. iPSCs的免疫原性
iPSCs及其产物的免疫原性与几个因素有关。
第一，未分化的iPSCs是移植物移植后发生排斥反应的主要原因之一。早期对小鼠的研究显示，未分化的iPSC在同基因受体中被排斥，而来分化的iPSC在同基因环境中不会引起免疫排斥。第二，来自同一iPSCs的不同细胞类型可能有不同的结果。在人源化小鼠中，iPSCs来源的平滑肌细胞会被免疫系统排斥，而视网膜上皮细胞则不会被排斥。第三，iPSCs来源的移植物的免疫原性由移植部位的微环境决定。另外，体外传代过长也会诱导的免疫反应。最后，线粒体DNA的重新突变可能是引起免疫识别和排斥的另一个因素。
研究人员开发了一系列方案以应对iPSCs的致瘤性和免疫原性，比如用无整合的方法，如腺病毒载体、仙台病毒、质粒载体和小分子化合物，使重编程过程更安全。在细胞中引入自杀基因，消除残留的未分化干细胞，实现无肿瘤移植。还通过识别和标记未分化的细胞标志物，研究人员能够监测体内中残留的未成熟细胞。
4. 遗传不稳定
iPSCs经体外培养和扩增的一段时间后，会出现染色体异常、遗传不稳定、拷贝数变异和杂合性缺失。140个独立的人类ESC系外显子组测序显示，与癌症相关的TP53突变频率更高，TP53突变等位基因比例随着传代数的增加而增加。此外，一项重要的观察发现，间充质干细胞在长时间培养过程中会发生突变爆发（mutational burst）。
2022年8月11日，Nature Genetics在线发表的文章发现，近72%的皮肤成纤维细胞来源的 hiPSC（F-hiPSC）存在紫外线导致的DNA损伤；血液来源的 hiPSC（B-hiPSC）的突变较少，但 26.9% 的 B-hiPSC 携带 BCOR 突变，且这种突变会带来功能性的后果。BCOR是多梳蛋白家族成员，维持细胞的自我更新和干细胞的分化，它的突变会引起包括肿瘤在内的很多疾病的发生。
5. 如何定义GOOD iPSCs
基于iPSCs及其分化衍生品的细胞替代疗法能否成功，主要取决于这些细胞在移植手术前的质量标准，因为这类细胞在分化潜能、表观遗传状态、致瘤性、免疫原性、成熟特征、批次间变异、谱系亚型细胞的存在、和/或不相关的污染细胞的存在等方面有着巨大的差异。
iPSC技术在短时间内为破译大量疾病的病因和病理生理机制以及治疗提供了前所未有的机会和启示。就全球iPSCs实验分布来看，日本和美国是压倒性的领导者，其中，治疗性的相关研究中有52.6%是在日本进行的；而非治疗性研究最多的是美国。中国虽起步略晚，但多家企业与机构积极布局，成绩斐然，2022年4月国内首个iPSC来源细胞药物的临床试验默示许可获CDE批准（呈诺医学的ALF201注射液），用于治疗急性缺血性脑卒中。
然而，目前全球iPSCs的研究尚处于临床初期，在临床应用等方面还有众多亟待解决的难点。希望随着相关研究不断深入、资本的入局以及专业的CDMO企业的助力，iPSCs这一年轻的赛道注定会缔造更多的奇迹。
作者|Dr.Yang 宜明细胞
E.N.D
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