细胞培养澄清收获的技术及经济考量：基于过滤的技术及其它策略
本文节选自“Technical and economic considerations of cell culture harvest and clarification technologies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“细胞培养澄清收获的技术及经济考量：碟片式离心和一次性离心机”。
在过去的几十年中，生物制药生产的生物工艺在上游和下游工艺方面都取得了重大的技术进步。上游细胞培养工艺的强化导致了更高的细胞密度，使更小的生物反应器能够提供与更大、更低滴度系统相同或更高的产量。这些高强度培养增加了上游和下游工艺之间的工艺负担：特别是收获分离，增加的负担可能会改变给定收获技术的一些技术和经济效益以及缺点。考虑到这些变化，我们在这里回顾了主要收获技术的操作基础，并讨论了生物工艺工程师在为其强化工艺选择合适技术时可能考虑的潜在因素。本文将总结在上游强化背景下“老化”技术面临的具体挑战，以及实施新策略和新兴技术的前进道路。利用生物工艺经济学建模工具，我们研究了两种广为接受的技术的经济性：碟片式离心和一次性深层过滤，并讨论了生物工艺趋势将如何影响这些收获方法的经济性。考虑到生物工艺不断变化和多样化的格局，可能没有万能的解决方案，并且必须仔细权衡许多因素，才能选择合适的收获分离技术。
深层过滤
深层过滤器 (DF) 传统上由多孔材料层构成，通常安装在用于死端过滤的膜盒内。对于收获应用，通常每个膜盒使用两层，每层具有不同的标称截留范围。顶层形成有粗孔结构并放置在较精细的层之上。这些层由采用纤维素组成的纤维床和树脂粘合剂形成，以形成片材。虽然纤维为过滤器提供了机械筛分颗粒的一般结构，但粘合剂能够表现出吸附性能。带电荷的树脂粘合剂可用于捕获带相反电荷的杂质。已经发现这种能力可以有效地捕获可溶性物质，例如DNA 和 HCP。硅藻土或珍珠岩等助滤剂也可用于帮助增加孔结构的表面积，从而增加吸附能力。
在收获之前，必须用水冲洗深层过滤器，以去除可能从过滤器基质中析出的任何松散颗粒和不需要的化学物质。冲洗后，将细胞培养物泵入过滤器。当进料流过深层过滤器时，颗粒和杂质在过滤器基质的整个深度范围内被捕获。分级的孔布局允许颗粒在过滤器中更均匀地分布，从而实现更有效地过滤。当孔被阻塞或收缩时，最终会发生污染。收获后，可以用缓冲液冲洗过滤器，然后用空气吹扫以回收过滤器中滞留的任何产品。虽然这增加了回收率，但它也可以释放捕获的过滤材料，导致过滤器流出物中的杂质含量更高。根据作者的经验，典型的收获后冲洗也可能导致生物反应器体积稀释5-10%。
在工艺开发过程中，过滤器的颗粒负载能力通过过滤器两端的压降和滤液浊度来确定。由于深层过滤器的吸附能力不能从压降来衡量，所以通过测量滤液的浊度来检测杂质的穿透。最大允许压力通常由制造商设定，通常为15 - 30 psig，但根据工艺的差异，可能使用更低的压力。高压会迫使杂质和碎片通过进入滤液而降低过滤效率。压力过低会导致过滤面积使用效率低下，从而导致过滤能力下降。一旦达到最大压力或设定的浊度水平，过滤器实际上已达到最大负载能力。
在大规模应用条件下，多列或排过滤器被装载到夹持系统上。对于工业规模的操作，可以在系统上将多列过滤器连接在一起。制造商之间的处理量限制可能会有很大差异，并且已经进行了多项研究来检查不同产品的处理能力。深层过滤器通常用于高达 2,000L 的体积，尽管它们在某些情况下，在高达 5,000L 的体积下可能在经济上具有可比性。如前所述，由于采用了死端过滤，深层过滤器可能对细胞密度敏感，在这个意义上，其不是一种稳健的工艺。此外，必须针对每种生物工艺条件表征深层过滤性能，因为细胞类型、细胞密度和培养基的变化、以及其它因素会影响过滤器性能。因此，当从小规模扩大到大规模通常需要纳入安全系数，以增加额外的过滤面积，这会增加成本。随着细胞密度的增加，深层过滤器难以与主要受时间而非过滤面积限制的碟片式离心机的体积处理能力相比。除了增加过滤面积外，在过滤之前使用絮凝剂或沉淀物可以通过更有效地利用过滤器基质来提高过滤能力。
对于深层过滤，实验室和中试规模的过滤器通常很容易获得，因此可以直接以小体积进行相对高通量的筛选。从实验室规模或中试规模进行规模放大时，首先要衡量滤液体积和澄清度、流速和压差等参数。根据收获后后续除菌过滤步骤的限制，确定最低滤液质量要求。确定上样容量的最常用方法称为Pmax™ 方法。当泵提供恒定的进料速率时，测量压力和滤液澄清度。一旦达到最大压力，确定上样容量。使用过滤器表面积和滤液体积，上样容量(L/m2) 在放大时保持不变。当扩大体积时，需要的表面积将比单个过滤器可用的表面积更大，并且过滤器可以并行运行。并行运行的另一个原因是减少工艺时间。当时间是限制因素时，针对每批次设定的工艺时间，通量(LMH) 在规模放大期间保持恒定。规模放大是在过滤器和细胞培养液特性保持一致的理想条件下计算的，但现实并非总是如此。通常需包括安全系数，以应对批次可变性，从而导致更高的运营成本。如果在工艺开发过程中没有做这样的考虑，低估过滤面积将导致下游成本增加。除了考虑培养液之间的可变性外，还需要进行研究，以检查过滤器批次之间的可变性。已经有报导发现过滤器处理量在批次之间发生了相当大的变化，即在规模放大过程中需要纳入安全系数。Lutz等人确定需要 1.2-1.6 的表面积安全系数，来补偿主要由过滤器批次变化引起的批次间变化。
图 1. 收获技术的分离机制概述。碟片式离心机 (DSC) 使用离心力来浓缩可在离心机外围去除的颗粒。一次性离心机 (SUCF) 有两种主要形式 - 管式离心机和离心淘析（Elutriation）。管式离心机（顶部SUCF）在狭窄的腔室中去除颗粒并允许连续分离。离心淘析（底部SUCF）平衡离心力和流体动力，以将颗粒保留为流化床。深层过滤器(DF) 通过截留和吸附可溶性杂质将颗粒截留在多孔介质中。切向流深层过滤(TFDF) 将流体切向输送到深层过滤器式介质，以减少过滤器基质的结垢。诸如切向流过滤(TFF) 和交替使切向流过滤 (ATF) 等微滤方法将流体沿膜表面切向进料，以减少过滤器结垢并根据孔径进行选择性过滤。
微滤
用于收获的微滤系统通常有两种形式：切向流过滤(TFF) 和交替式切向流 (ATF) 过滤。这些过滤系统以可重复使用和一次性使用的形式提供。过滤器组件要么是平板膜，要么是更典型的装在管中的中空纤维。平板膜放置在塑料盒中，塑料盒可以以与深层过滤膜盒类似的方式堆叠。中空纤维过滤器由包装在圆柱形滤芯中的一束中空纤维组成，并且由于它们可作为一次性设备广泛使用而更为常用。在这两个系统中，进料与过滤膜表面平行或相切地泵送。膜两侧的压力差称为跨膜压(TMP)，驱动含有产品的滤液通过膜。细胞被截留并再循环到进料储罐。在ATF 中，流动方向由隔膜泵实现交替运动。交替流动有助于防止长时间的工艺过程中出现的污染，是灌流培养的理想选择，但出于与微滤方法相关的典型较短持续时间和费用考量，不太常用于一般细胞培养液的收获。
当颗粒阻塞或收缩膜孔、限制流动时，就会发生污染。当流体切向流向膜表面时，流体速度会扫除膜表面的颗粒堆积并减少沿表面的污染。另一种可以显著限制跨膜质量传输的机制是浓差极化。在膜表面形成一层浓缩的颗粒，限制流动。随着TMP 的增加，污染的可能性也会增加。由于TMP会随着通量的增加而增加，通量最终将达到最大速率，而压力仍会提高。为了优化体积处理量并限制污染，通量通常保持为略低于最大允许通量的速率。
随着细胞密度的增加，微滤系统将难以在处理能力上与其它系统相匹配，如深层过滤或离心，尤其是在相同的工艺时间框架内。提高微滤能力的一种方法是选择性地使用过滤器类型和孔径。为了减少由固体增加引起的过滤器污染，可以使用更大的孔径。这减少了小悬浮固体的截留，因此必须进行额外的澄清步骤，例如深层过滤，以保护下游工艺。细胞密度的增加会降低可实现的通量，并且可能会将微滤操作延长到超过典型的 8小时班次。这种冗长的收获时间限制了微滤可用作收获工具的规模和强度。然而，微滤可以在数天或连续（例如灌流）的操作中实现长时间的低流速收获，这可以提高总体产量并减少或消除对二级澄清步骤的需求。
微滤的过滤器处理量研究和规模放大过程类似于深层过滤，但通量是使用滤液流速测量的。TMP 和通量的图可以分为两种情况，一种是压力相关的情况，其中通量和TMP 具有正相关关系，另一种是压力无关的情况，其中通量趋于稳定，且更高的TMP 不能增加通量。该稳定期的开始可用作最佳操作条件，此时通量最大，且没有过高的压力。规模放大后，通量保持恒定。由于通量取决于细胞密度，因此在确定所需的过滤面积时会包括一个安全系数，来计入任何可能的工艺变化。
其它基于过滤的收获技术
切向流深层过滤（Repligen 的 TFDF™）是一种在流路和自动化方面遵循与TFF 类似操作方法的技术。TFDF将切向流过滤的污染降低与深层过滤器基质的颗粒截留能力相结合。如图 1 所示，过滤器由管状深层过滤器矩阵构成，具有供进样液流通过的内腔。一部分培养液首先被过滤，而截留液被回收，在生物反应器或储罐中浓缩细胞。然后将缓冲液加入储罐以维持细胞浓度（洗滤过程），同时收集滤液，得到稀释的产品。由于洗滤步骤，TFDF产生的产物池相比原始生物反应器体积通常会被稀释约~ 20%。整个过滤过程是自动化进行的。该技术被宣传用于取代初级深层过滤和离心，处理量可高达 2,000L。
另一种相对较新的生物工艺过滤技术是循环过滤，例如DrM, AG 的 STERIBAC® 技术。在这种技术中，袋状滤膜松散地悬挂在压力容器内。在膜袋内，有一个或多个“手指”或“蜡烛” - 刚性多孔管 - 连接到压力容器的顶板以收集滤液。培养物在压力下注入底部，驱动过滤袋收缩至“手指”，过滤后的物料在过滤器外部结块。在滤饼足够大或跨膜压力过高后，漂洗缓冲液反向向下流过“手指”，过滤器洗掉并处理滤饼。当过滤器没有滤饼时，可以重复过滤循环，直到最终用户收集到所有所需的收获物。虽然此类技术已用于其它行业，但据我们所知，它尚未在生物工艺领域找到突出和广泛的立足点。
水力旋流器
水力旋流器是另一种利用离心力从液体中分离固体的装置。水力旋流器由两个主要部分组成：圆柱形部分和截锥形部分。进料通过圆柱形部分切向进入装置，当流体围绕锥形部分流动时，流体流动形成旋流分离器。较大的颗粒被推到壁上并集中在锥体的窄端，在那里，它们在底部出口的底流中被去除。较小的颗粒在从内部涡流中溢出时被去除，因为它们朝向与圆柱形部分同心的顶部出口上升。商业化的水力旋流器不是为哺乳动物细胞分离而设计的，例如 Sartorius BBI Systems的产品，但已被用于灌流培养。一些专为灌流应用设计的旋流分离器原型机已被用于实现高达99% 的分离效率。需要小型水力旋流器来实现这些高分离效率。提高进料速率会导致整个设备的压降更高，这已被证明会使细胞活性降低多达11% 。细胞活性降低、流速低和脱水能力低可能是水力旋流器未广泛用于收获分离的原因。
沉降
用于收获细胞的最简单机制之一是通过重力沉降。重力沉降装置利用与离心机相同的分离原理，但使用重力、根据密度差异分离细胞。第一种使用的形式是使用逆流流动的沉降池。当细胞沉降到罐底部时，液体会与沉降相反地流动。液体速度必须低于细胞沉降速度，以确保沉降。第二种形式是最有效的，它使用两个紧密安装在一个斜坡上平行板。同样，流体逆着沉降池流动。细胞聚集在底板上并在倾斜的沉降面上向下流动。虽然主要被视为不锈钢设计，但也存在一次性沉降器，例如Sudhin Biopharma 的BioSettler。由于流速慢且需要较大的沉降表面积，此类系统在收获大体积产品时，有不小的挑战。这些沉降器通常用于不需要高流速的灌流系统。沉降器尚未显示出收获高密度细胞培养物的潜力。分离细胞所需的长停留时间和低流速阻碍了工业规模的应用。相比于使用额外的重力沉降设备，Schmidt等人证明生物反应器中的重力沉降可用于提高深层过滤器的处理能力，以处理更大的体积和更高的细胞密度。付出的代价是额外的沉淀工艺步骤会使工艺时间增加12 - 22 小时，从而延长批次之间的周转时间。
声波分离
Pall的Cadence™ 声学分离器是另一种被宣传用于替代初级深层过滤和离心的收获技术。该技术在一次性使用的声学室中使用声力来产生细胞聚集，这些聚集体很容易从悬浮液中沉淀出来。流体被泵入声室，细胞被超声波截留，随着更多细胞的积累，它们开始聚集并由于重力和浮力降低而从溶液中分离出来。细胞沉降到腔室的底部，在那里，它们被不断地去除。该系统宣传的处理量可达25 L，但一项研究通过将收获时间延长至14 小时，成功收获了 50 L。由于流速低，< 4 L/h，并且没有规模放大模型，因此在中试规模操作以上收获更大的体积是不切实际的。
絮凝和酸沉淀
为了提高收获工艺的处理能力，可以使用絮凝剂和沉淀技术。絮凝剂的使用增加了进料流中固体的平均粒径分布，从而可以更好地利用过滤器基质。这是使用壳聚糖等絮凝剂来絮凝细胞和细胞碎片而实现的，换句话说，它会导致固体颗粒聚集在一起。氯化钙和磷酸钾等化合物也可用于沉淀和絮凝可溶性杂质。对于深层过滤工艺，絮凝可以消除两级深层过滤所需深层过滤器一半左右，降低耗材成本，并绕过了在大体积或高细胞密度情况下对离心的要求。例如，Tomic等人观察到所需的过滤器表面积减少了四倍。使用絮凝剂时，必须使用特定的深层过滤器，例如EMD Millipore 的 Clarisolve® 深层过滤器。这些过滤器专为预处理后进料液流而设计，以形成单级澄清工艺。深层过滤器由粗到紧的分级孔隙结构组成，以应对预处理培养液的粒度分布。当使用离心作为初级澄清步骤时，絮凝剂的使用可以增加一倍到四倍的通量，具体取决于培养条件。在离心过程中，较大的聚体比单个细胞更容易去除，从而实现更高的流速。McNerney等人表明对于高细胞密度，絮凝剂甚至可以完全替代离心。尽管絮凝剂可以显着提高产量和处理量，但它们并未广泛用于工业。对于下游残留絮凝剂的去除以及絮凝剂对产品质量的影响存在监管问题。这增加了工艺开发过程中验证任何絮凝剂对产品的影响的时间和成本。絮凝结合前面讨论的收获技术的混合工艺有可能可应对当前上游滴度不断提高的趋势。在更好地了解絮凝对下游工艺和产品的影响之前，絮凝在工业环境中的使用不太可能增加。
收获前的酸沉淀可以更容易地去除培养物中的杂质，例如 HCP 和 DNA。酸沉淀降低了某些杂质的溶解度，使它们沉淀为更大的固体颗粒。然后可以在收获阶段更容易地去除这些固体颗粒，并减轻除菌过滤器和层析纯化的大部分负担。但必须纳入产品稳定性的考虑因素，因为 pH 变化可能对产品质量有害。
原文：W.A.Dryden, L.M.Larsen, D.W.Britt, et al., Technical and economic considerations of cell culture harvest and clarification technologies. Biochemical Engineering Journal, 167 (2021) 107892.
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