用于验证病毒安全措施的一次性规模缩小下游工艺
本文节选自“Single-use down scale downstream processing for validation of viral safety measures”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
简介
哺乳动物细胞培养，自从开发了第一个在中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 中表达的、用于急性心肌梗塞和中风的生物药组织纤溶酶原激活剂以来，已成为一种独特的工具，可用于15,000– 20,000L 大型 cGMP 规模全自动搅拌罐生物反应器，包括糖基化、复杂且二硫键丰富、需要正确体内折叠的治疗蛋白。与在大肠杆菌或毕赤酵母等微生物中合成的非糖基化治疗蛋白（如胰岛素、干扰素、白细胞介素、G-CSF和生长激素）不同，糖基化治疗蛋白，包括哺乳动物细胞培养生产的因子VIII、促红细胞生成素、组织纤溶酶原激活剂和单克隆抗体，可能被污染，如宿主细胞或细胞培养基源性蛋白质、宿主细胞DNA、可从Protein A 层析填料中脱落的配基、来自受污染原材料的内毒素、来自宿主细胞系的内源性病毒以及来自培养基或环境的外来病毒。
潜在杂质的来源是宿主细胞源性成分，例如宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、内源性病毒、脂质、碳水化合物；细胞培养基源性成分，例如来自复杂培养基或添加物的蛋白质、肽、蛋白胨、脂质和抗生素以及消泡剂；外来因子，如病毒、支原体、细菌、真菌；来自生产过程的微生物污染的细菌内毒素，例如脂多糖；可浸出物，例如来自亲和层析的配基，如Protein A 和赖氨酸；赋形剂，例如tween 20、tween 80 或 triton X-1004 等去污剂。
这些潜在杂质必须在主细胞库和工作细胞库的选择、建立和表征、原材料测试和下游工艺的杂质清除验证中得到解决。
所有国际监管机构都发布了相关药典和指南，以应对生物制药中的杂质安全问题。这些例子包括：
ICH 主题 Q5 A，步骤 4 共识指南。生物技术产品质量指南注释：源自人类或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评估(CPMP/ICH 295/95)。 EC CPMP 病毒验证研究指南说明：验证病毒灭活和去除的研究的设计、贡献和解释(CPMP/BWP/268/95)。 美国FDA 关于在生产和检测人用单克隆抗体产品时需考虑的要点（1997 年2 月28日）。 EMEA/CPMP/BWP 398498/2005 生物技术研究性医药产品病毒安全评估指南。
在中国，与单克隆抗体生产的病毒安全性相关的监管环境在2010 年中国药典中有所体现，并预见了用于生物药生产和鼠病毒检测的动物源性细胞底物的制备和控制要求。为开展此类研究，中国食品药品监督管理局(CFDA/NMPA) 发布了多项指南。
人用单克隆抗体质量控制指南，1997 年 2002 年血液/血浆制品病毒去除和灭活指南 [S]GPH3-1 从组织中提取或从真核细胞系表达的生物技术产品的病毒安全性评估原则，2007 用于重组 DNA 产品的细胞底物质量控制原则，2007 年
细胞底物
预防病毒污染最重要的是建立无病毒的主细胞库和工作细胞库（MCB/ WCB）。各个监管部门都有许多指南。
建议使用经过验证的无病毒高表达哺乳动物宿主细胞系，最常见的是CHO DG 44，该细胞系具有所有功能 - 例如促进 CERP 或CD C 42 基因通过哺乳动物细胞系的高尔基体转运，提供高生产力和正确折叠，通过宿主细胞的敲除突体或插入来自铜绿假单胞菌共表达的GDP-6-脱氧-D-来苏糖-4-己酮糖还原酶以转化中间体GDP-4-keto-6-脱氧甘露糖（GDP-岩藻糖途径的底物）为GDP-D-鼠李糖而实现对单克隆抗体碳水化合物模体的去岩藻糖基化活性，从而转移内部岩藻糖合成，导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC) 的增强，低蛋白水解活性以避免治疗性蛋白质的剪切位点，成为内源性蛋白质，与基因表达的治疗性蛋白质相似，遗传稳定性高，可放大到商业化生产：对基因表达治疗蛋白具有高可生产性的商业可行宿主细胞的各种必要要求。在将编码目的基因的高表达载体克隆到宿主细胞之前，这些特征应该已经构建到宿主细胞中，以节省时间并尽可能降低最终MCB / WCB 中病毒污染的风险（表1）。
表1. 细胞库表征的必要检测
用于除病毒研究的模式病毒
对于除病毒研究，应选择不同的病毒，如根据其基因组的不同：RNA或 DNA，单链或双链；形状：有囊膜或无囊膜；以及对去污剂的抗性，从而覆盖宽泛的病毒类型，且除病毒步骤需至少验证为总log降低10E 24。下游工艺中的每一步都将有助于整体log降低，即使它不仅仅用于病毒清除（表 2，3）。
表2. RNA模式病毒选择
表3. DNA模式病毒选择
为了验证不同的除病毒步骤，表型表征的病毒加标材料必须以高浓度和质量提供，以便确定病毒加标材料的显著log降低。如果不将整个除病毒研究外包给服务实验室，病毒加标材料需优先从合格的病毒实验室购买，其应具有40 多种不同自然宿主的表征病毒株，并在客户服务水平方面具有良好的可跟踪记录，可重现的高标准病毒加标材料，以及高滴度病毒储液10^7 – 10^8 TCID50/ml。抗病毒功效测试是在基于细胞的分析中进行的，因此除了高滴度病毒储液的可用性之外，敏感细胞系也是低检测限的先决条件（表 4）。
表4. 用于除病毒研究的病毒加标物料。根据各个工艺步骤的缩小规模和体积，病毒滴度范围应为10^7– 10^8 TCID50/ml。
下游工艺设计
在下游工艺中，优先在第一步中，治疗性蛋白质通过特定的配基层析法（例如赖氨酸琼脂糖凝胶或Protein A）与不同的层析填料偶联，以去除宿主细胞蛋白质，尤其是蛋白酶，并浓缩目标蛋白质分子。所需蛋白质的洗脱在pH3.5 左右进行，其已经有助于病毒灭活。（图1）。
图1. 下游纯化工艺
在接下来的步骤中，在pH 3.4 至 3.9 范围内的低pH 值下保持长达 40 分钟的特定时间段 - 这取决于治疗性蛋白质的稳定性 -作为第一个直接的病毒安全措施，病毒被灭活。提供尖锐洗脱峰和足够的病毒清除率的阳离子交换层析主要用于去除聚体，其可在低pH 条件下形成。流穿模式下的阴离子交换层析或阴离子交换膜过滤旨在有效去除宿主细胞DNA和病毒。
对于除病毒验证，必须针对单个层析和过滤工艺建立和验证商业化工艺的规模缩小工艺，其重点是层析中的柱床高度、蛋白质浓度、动态结合载量和线性流速，过滤的恒定流速 (L/hr/m2)。必须证明每个单元操作的稳健性，并且必须确定和解决影响每个步骤有效性的关键参数。必须证明各个降低因子的总和与整体降低因子是合理的。针对病毒上样的每个层析或过滤步骤的降低因子主要取决于蛋白质浓度、电导率和pH 值，并取决于病毒的等电点：SV 40 5,4；X-MuLV 5,4 和MVM 6,2，（表 5）。
表5. 规模缩小模型的计算
在工艺开发和生产中越来越多地采用一次性和可抛弃型系统，这需要改进下游设备创新，特别是对于“即用型”层析柱。这些一次性设备当然需要一定的标准化，如果应用于整个生物制药生产过程，则此前作为不锈钢操作设施的工厂将需要不同的设计。
用于高通量纯化工艺开发的微量层析柱
目前，行业已经开发了一种新的平台技术，首次实现了96孔板阵列形式的柱层析。
该设计允许用户选择任何层析材料，这些材料在装填时充分考虑了各个材料的压缩要求。两个过滤器筛板之间的柱床密封确保了与制备型和工艺分离柱相似的高效率和峰对称性，并将该系统与此前基于过滤器的系统区分开来，以便进行简单的样品平衡操作。
层析柱中的液体流动由正压液体置换驱动，就像在单独连接到单通道独立层析系统的层析柱中的情况一样。8根层析柱并行操作以及预编程的缓冲液制备，可快速进行 12排层析柱的操作。
使用自动微孔板运输系统将分步洗脱的馏分收集到标准96 孔微量滴定板中，随后转移到下一个分离步骤，以进行进一步的色谱维度或分析，如UV、ELISA、MS、HPLC或 SDS-PAGE。
这形成了完全自动化的无人值守程序，处理时间可大幅减少70%，并显著提高了过程安全性。应用表明，在治疗性蛋白质生产的工艺开发以及用于MAb 生产的发酵液的过程监控中，这种技术可成功用于参数阐明和优化。
用于生产的创新预装工艺层析柱
可抛弃型、预装、预质量确认的层析柱平台适用于治疗性蛋白质的纯化，例如临床前、临床 I期和 II 期研究以及全规模生产的单克隆抗体和疫苗，取决于发酵工艺的规模和滴度。
层析柱的创新设计允许直接连接到最先进的一次性层析系统，以及装填各种不同粒径的市售层析填料，包括刚性、半刚性和软聚合物骨架。
透明的层析柱外壳允许在层析工作流程中从上到下进行柱床检查。优先使用预装的一次性层析柱，装填与商业化生产中相同批次的层析填料。这些层析柱专为功能性规模缩小建模而设计，内径范围为 5至 25 mm，层析体积为 0.4 至300 ml，具有灵活且精确的柱床高度，可用于商业DSP 的缩小规模，可以装填任何层析填料。这些层析柱采用正确的轴向压缩流动装柱，以模拟商业规模层析柱的性能，并针对理论塔板、不对称性和压力流速进行了验证和认证。这提高了柱效和峰对称性。所有层析柱均附有性能证书，以确认柱效、峰对称性和流速。精密硼硅玻璃设计确保整个柱床高度范围的生物相容性和可视化。方便的直径规格确保了病毒加标上样材料的最少浪费。预装柱不需要从病毒污染物中再生，但在高压灭菌后是一次性的（图2,3）。
图2. 通过叠加16根层析柱的HETP 曲线测试装柱的可重复性。
图3. 通过叠加16根层析柱的压力流速曲线测试装柱的可重复性。
标准化的装柱程序和系统确保重复的层析柱具有与单个单元认证所确认的相似的性能特征。所有类型的层析材料，包括基于琼脂糖的凝胶、聚合物树脂、复合树脂和二氧化硅加工材料都可以进行预装。任何大于10 µm 的粒径都可以根据层析目的预先装填到所有几何形状中。可以适应所有层析模式，包括市售层析填料中的IEC、HIC、SEC、AFC 以及新一代混合模式填料。
层析除病毒
在典型的下游工艺中，层析可以实现显著的病毒清除因子，但对于不同的病毒是不同的。此外，清除因子也取决于细胞培养基、宿主细胞DNA 含量、发酵条件和治疗性蛋白质特性，并且必须针对每个单独的生产过程进行验证。（见表 6）
表6. 除病毒验证研究：层析
病毒灭活
如表 7 所示，通过低 pH 对囊膜病毒进行病毒灭活，对囊膜病毒和非囊膜病毒在微波流通中进行热处理，流通紫外光常用于ds DNA 和 ss DNA 病毒，对囊膜病毒也可使用溶剂或去污剂。
表7. 物理化学病毒灭活方法
在所有这些灭活步骤中，重要的是使用模式病毒和治疗性蛋白质的灭活动力学曲线以定义病毒灭活的设计空间，而不影响蛋白质质量，特别是对于聚体的形成或增强，这可能是在ProteinA 层析的低 pH 洗脱过程中已经形成的。（图4）
图4. 使用模式病毒的低pH孵育动力学曲线
为了最大限度地减少聚体的形成，可以使用替代性层析ProteinA 填料，其在低于 10°C 的中性 pH 条件下上样并在37-40°C 的 pH 8.0 条件下进行洗脱。在这些条件下，在从Protein A 亲和层析洗脱期间没有形成聚体，在低 pH 病毒灭活步骤期间形成较少的聚体。（图 5、6、7、8）
图5. 避免低pH洗脱的ProteinA亲和层析
图6. 在低pH 3.0和pH8.0 Protein A亲和层析洗脱时收获
图7. pH 8.0和低pH 3.0 Protein A亲和层析洗脱时的聚体形成
图8. 在Protein A亲和层析pH8.0和低pH 3.0洗脱后以低pH 3.5病毒灭活时的聚体形成，以体积排阻层析检测
对于连续病毒灭活工艺，除了微波热灭活外，还可考虑使用紫外光，其可放大至100 L（表 8）。
表8. UV光连续病毒灭活可达100L
在 45J/m2 以上的剂量下可以实现 PP7 的有效灭活。对于较小的无囊膜病毒，如PPV，是目前最有效的灭活方法，UV病毒灭活符合病毒灭活技术稳健性的监管要求。
纳滤除病毒
第二种直接除病毒安全措施是一次性纳滤。根据20 至 800 kD 范围内治疗性蛋白质的不同分子量，可以应用不同的一次性纳滤过滤器。
纳滤是一个非常强大的除病毒步骤，也是一个关键步骤。例如，在膜超载或压力释放后，可能会发生病毒突破，并且在滤液中可检测到病毒。其它一些参数，如基质的pH 值、温度、离子强度或压力释放的持续时间也很重要，并且对病毒突破有影响。
在一次性纳滤的规模缩小模型中，重要的是流速呈线性，如图 9所示。
图9. 线性可放大性
此外，还要考虑到一些过滤器对病毒加标材料的纯度很敏感，这要么影响纳滤过滤器的选择，要么影响病毒加标的纯度。
纯度更高的病毒可最大限度地减少加标对过滤性能的影响。可以通过在无血清细胞培养基中培养宿主细胞、病毒收获物的超速离心、病毒的沉淀或病毒的层析分离或上述方法的组合来获得纯化的病毒加标。病毒加标通常会检测蛋白质和DNA 含量以及是否存在细菌、真菌和支原体。
新兴病毒
麻省理工学院生物医学中心外来物质污染联盟(CAACB) 报告的、污染生物生产操作的病毒包括CVV、Orbivirus（环状病毒）、MMV 和Vesivirus （疱疹病毒）2117。所有这些报告的污染都发生在 CHO 细胞中。在几乎所有 CAACB 调查的污染中，培养基成分都被确定为污染源，或与污染相关（表 9）。
表9. 已知污染事件的年代表
除了已经提到的 EHDV、人类腺病毒、PCV-1 和呼肠孤病毒的病毒株污染外，还报告了来自非联盟成员公司的其它事件。这些已公布的污染事件发生在各细胞系中，包括BHK-21、HEK293、Hu 1° 肾和Vero 细胞。大多数 CAACB 调查病毒都进行了表征，许多可用于进一步研究。此类病毒和其它新兴病毒（如圆环病毒）可用于成熟病毒实验室的除病毒研究。
如果将这些新兴病毒与常规病毒清除研究中使用的模式病毒进行比较，显然存在一些差异。因此，值得在进一步的除病毒研究中考虑此类病毒，以确定治疗性蛋白质的安全性（表10）。
表10. 模式病毒与生产工厂中污染性病毒的比较
DNA 污染和DNA清除
宿主细胞 DNA 清除必须考虑的问题是，治疗性蛋白质的规格是每治疗剂量 <100 pgDNA，因此高剂量蛋白质治疗产品（如单克隆抗体）需要比低剂量蛋白质治疗产品（如促红细胞生成素）高得多的清除因子。一种有效的宿主细胞DNA (HCD) 去除步骤是阴离子交换层析和更有效的阴离子交换膜过滤。
内毒素清除
源于哺乳动物细胞培养物的蛋白质溶液中存在的来自革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）的细菌内毒素是外来物质，因此可能表明无菌cGMP 工艺的失败。
防止内毒素污染的措施包括对原材料进行检测以及对原材料的内毒素规格进行检测，尤其是来自生物来源或酶被用于处理低分子量化合物的情况，使用纯化水进行清洁和灭菌程序，使用纯化水或注射用于进行缓冲液制备，用于蛋白质下游工艺的缓冲液的LAL检测，含工艺流体产品的LAL检测。此外，有效去除内毒素的工艺步骤必须纳入DSP ，并验证其可有效去除潜在的内毒素污染。同样，对于清除HCD 有效的阴离子交换膜过滤，对于去除潜在的内毒素污染物也是有效的。从GST 蛋白酶中去除的内毒素从 26.000 EU/mg降低到 0.13 EU/mg。蛋白质溶解在 TRIS/NaCl 缓冲液中，pH8（表 11）。
表11. 使用阴离子交换膜进行的内毒素清除
结论
杂质可能与宿主细胞、细胞培养基、员工、工艺或产品以及HCAV 系统有关。因此，对起始材料的控制是必不可少的，应重点关注病毒、宿主细胞DNA、内毒素和宿主细胞蛋白，这些都是主要关注的问题。必须验证下游工艺，以去除预期和潜在的杂质。检测分析程序必须灵敏且经过验证。必须确定治疗性蛋白质和杂质谱的异质性。产品相关的异构体和杂质(>0.1 %) 应进行表征。对于 cGMP 生产批次，必须证明异质性和杂质谱的批次间一致性。必须按照国际监管指南建立规格限制，并通过安全研究中管理的实际杂质数量的分析批次结果来证明其合理性。在安全性和临床试验中经过充分测试的任何杂质的水平被认为是合格的。对于潜在病毒污染物的除病毒验证，必须将至少两个正交除病毒步骤纳入下游工艺并验证病毒清除，同时通过额外的层析步骤验证除病毒支持。生物制药生产的潜在杂质情况是已知的，并且有技术和措施可用于解决下游工艺中的安全问题。
原文：R.G.Werner, Single-use down scale downstream processing for validation of viral safety measures.BioPharma Asia, 2021.
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