切向流过滤促进人体红细胞漂洗：概念验证研究
背景和目标：低温储存中的红细胞 (RBC) 单元会随着时间的推移而降解，通常称为 RBC 储存损伤。这些老的RBC 单元在输血时会引起不良的临床影响，因为老的 RBC 会溶解并释放无细胞血红蛋白 (Hb)，这是一种高效的血管舒张剂，可在输血后引起血管收缩、全身性高血压和氧化性组织损伤。在本研究中，我们研究了一种使用离心泵驱动的切向流过滤 (TFF)技术，以清洗体外储存的单个 RBC 单元，去除积累的细胞废物，特别是无细胞 Hb。
材料和方法：TFF RBC 漂洗系统在 4°C 的低温条件下运行，系统体积恒定，用 0.9 wt% 的盐水作为漂洗溶液。RBC 漂洗工艺在 10 个单独的 RBC 单元上进行。对于这项概念验证研究，RBC 单元在漂洗时已过期（60 - 70 天老龄）。无细胞 Hb 通过UV-可见吸收光谱进行量化，并通过 Winterbourn 方程进行分析。通过 Hemox分析仪、Coulter 计数仪和 Brookfield 流变仪分析漂洗前、后的 RBC 样品。在整个漂洗过程中通过标准血细胞比容 (HCT) 分析测量溶液中的 RBC 体积分数。
结果：在 TFF RBC 漂洗过程中没有观察到 HCT 的显著降低。然而，在 TFF RBC 漂洗过程的前半部分 RBC 浓度显著降低，在 TFF 细胞漂洗过程的后半部分 RBC 浓度没有显著变化，与总数相比，总细胞回收率为细胞漂洗开始前的87%。通过对每个洗滤循环的回流液和滤液样品进行 Winterbourn 分析，对溶液中可能存在的每种 Hb 物质的消光系数和特征峰的利用进行量化，以定量漂洗过程中的 Hb 浓度。在前四个洗滤循环中观察到显著的无细胞 Hb 减少，RBC 单元中的起始无细胞 Hb 浓度为 0.105 mM，在获得的漂洗后单元中，其稳定至恒定 Hb 浓度为 0.01 mM 或总细胞外 Hb 质量 0.2 g。氧平衡曲线显示初始和最终 RBC 样品池之间的 P50 显著降低，初始 P50 为 15.6 ± 1.8 mm Hg，最终 P50 为 14 ± 1.62 mm Hg。与最终值2.52 ± 0.12 相比，初始希尔系数 2.37 ± 0.19 在漂洗后协同性增加。
总结：总体而言，本研究调查了 TFF 用于漂洗单个 RBC 单元的概念验证使用，重点是从单元中去除无细胞 Hb。与传统的细胞漂洗程序相比，所设计的系统能够更有效地去除细胞外 Hb，但导致漂洗时间更长。为了更全面地研究 TFF RBC 漂洗过程，应进一步研究对漂洗后 RBC 单元储存的影响。设计的系统轻便且可运输，能够在使用之间保持无菌状态，为临床应用中的床边离体输血提供了潜在的选择。
重点：
• 使用 TFF 漂洗 RBC 可以显著降低 RBC 单元中的游离 Hb 浓度。
• 使用TFF 漂洗细胞不会对RBC 群体产生负面影响。漂洗前后的红细胞呈现出基本相同的氧平衡曲线。
• RBC 与中空纤维内壁之间的剪切应力在漂洗过程中不会增加溶血作用，并且在整个漂洗过程中总 RBC 浓度保持不变。
在美国食品和药物管理局 (FDA) 设定的最长 42 天储存期内，红细胞(RBC) 在离体储存期间会发生降解，并导致有毒溶血副产物在单元内积聚，例如血红蛋白(Hb)。输血后，储存的红细胞单元中的无细胞Hb 可以从血液渗入组织空间，在那里，它清除一氧化氮，一种有效的血管扩张剂，并在患者体内引起血管收缩和全身性高血压。此外，无细胞Hb 的组织外渗导致铁的组织沉积并不可避免地导致氧化性组织损伤。
因此，鉴于离体红细胞储存期间溶血副产物的积累，通常采用特定的红细胞漂洗方法，以在输血前清除红细胞单元内积累的废物，以减轻任何潜在的副作用。许多商业上可用的技术在临床上被用于在输血前漂洗储存的红细胞单元。
由于成本低，RBC单元的手动漂洗装置是一种有吸引力的方法，但它费力，处理量受可用离心杯尺寸的限制，并且面临着细菌污染的高风险。相比之下，自动化 RBC单元漂洗系统最常用于临床环境中，以去除有毒副产物，例如COBE 2991 细胞处理器（Terumo）。COBE 2991 是一种开放式细胞处理系统，它利用离心来实现基于血液成分密度差异的分离，并且可以有效地减少促炎标志物，在接近单元的离体保质期结束时恢复整体RBC 质量。不幸的是，使用 COBE 2991 漂洗后溶血水平迅速增加，并且在达到 24 小时输血窗口之前经常超过漂洗前的水平。针对COBE 2991 漂洗40 - 42 天储存RBC 单元的研究工作表明，漂洗后，COBE 2991 无法在漂洗过程后显著降低总游离 Hb，Hb 是一种储存损伤的毒性副产物。针对这一限制，显然迫切需要一种创新的、易于使用的RBC 漂洗系统，以解决当前手动和自动漂洗系统的缺陷。
针对该应用，基于离心的现有 RBC 漂洗系统较多，而对于使用切向流过滤 (TFF) 进行 RBC 单元漂洗的研究却少得多。TFF利用多孔中空纤维或平板膜包来实现连续液流纯化。大于膜截留孔径的分子保留在系统中，而小于截留孔径的分子渗透通过膜并从系统中去除。在全血上使用TFF 技术的研究主要集中在将全血分离成血浆和RBC 部分。与离心分离相比，TFF 系统可以处理范围广泛的 RBC 浓缩液体积，便于储存溶液置换，并能够通过使用可高压灭菌的材料和封闭回路系统而保持无菌性。此外，本研究设计的TFF 系统轻便且易于运输，整个系统（包括系统容器、泵、管路和中空纤维过滤器）重量不到 2公斤。此前，有研究使用 TFF 以洗滤模式漂洗 RBC，并浓缩了冷冻保存的RBC 单元，但导致 RBC 明显溶解（很可能是由于使用了蠕动泵），该研究还专注于探索了漂洗单元的流变特性。在本研究中，我们探索了一种新型TFF 系统的实施，该系统使用低剪切应力离心泵，将储存的红细胞与其主要溶血副产物Hb 分离。这项概念验证研究开发了一种系统，其可有效漂洗RBC 单元，成功去除无细胞 Hb，过程引起的溶血可忽略不计，为当前的手动和自动 RBC 漂洗系统提供了可行的替代方案。这是一项概念验证研究，我们使用过期的储存人类红细胞，并以盐水作为漂洗溶液，评估了TFF 促进的红细胞漂洗效果，以研究红细胞单元质量的绝对最坏情况。未来的研究将侧重于漂洗未过期的存储RBC 单元，使用 FDA 批准的存储溶液作为漂洗溶液，并将分析扩展到无细胞 Hb 之外。
详细实验操作和结果分析，请参考原文。
图1. 红细胞 (RBC) 漂洗工艺的流程图。使用切向流过滤(TFF) RBC 漂洗系统处理了正好 10 个 RBC 单元。(1) 含 0.9 wt% 盐水的容器；(2) 用于回流液取样的取样口；(3) 回流容器、0.65-μm TFF 过滤器（Repligen中空纤维组件，产品编号S02-E65U-07-N，改性聚醚砜，0.65μm，内径0.75mm，总面积520cm2，含110根纤维），用于清洗红细胞；(4) 离心泵（Levitronix，PuraLev i30SU）；(5) 来自工艺过程的滤液废物（包含尺寸<0.65 μm 的物质）以及(6) 细胞废物。箭头表示流动方向。
图2. 红细胞 (RBC) 漂洗过程中每个洗滤循环的时间在洗滤循环之间没有显著差异(p = 0.999, NS) (a). 血细胞比容(HCT) 在 0-洗滤循环时标准化为 45%，并且在漂洗过程中没有显著降低(p = 0.124, NS)。(b) 切向流过滤 (TFF) 系统内的细胞计数在洗滤循环中的测量。(c)从 0-洗滤循环到10-洗滤循环的细胞计数变化的方差分析是显著的（p= 0.0107，*），在 0-洗滤循环到 4-洗滤循环之间发现了额外的显著性（p = 0.031，*）。使用TFF RBC 漂洗系统处理了 10 个 RBC 单元。
图3. 使用切向流过滤 (TFF) 进行10 个红细胞 (RBC) 漂洗洗滤循环的回流液无细胞血红蛋白 (Hb) 浓度 (a)。使用TFF RBC 漂洗系统处理了正好 10 个 RBC 单元。对数据子集 0x至 10x 洗滤循环、0x 至 4x洗滤循环以及 4x 至 10x 洗滤循环进行方差分析(ANOVA) 检验。在 0x 至 10x 洗滤循环(p = 8E-16, ***) 和 0x至 4x 洗滤循环 (p = 2.8E-7, ***) 亚组中发现了显著性。使用Tukey 诚实显著差异 (HSD) 发现 0x 洗滤循环与 1x、2x、3x和 4x 洗滤循环之间存在显著性差异（分别为 p = 0.001、2.9E-5、1.6E-6和 7E-7）。在 4x 到10x 洗滤循环亚组中没有发现显著性 (p = 0.458,NS)。虚线表示 1% 溶血。使用 TFF 进行10个 RBC 洗滤循环中滤液无细胞 Hb 浓度(b)。对数据子集 1x 至 10x 洗滤循环、1x至 4x 洗滤循环以及 4x 至10x 洗滤循环进行 ANOVA 测试。1x 至10x 洗滤循环 (p =6.2E-15, ***) 和 1x 至 4x 洗滤循环(p = 1.6E-5, ***) 的数据具有显著性。在 1x至 4x 洗滤循环亚组中，使用 Tukey HSD 发现 1x洗滤循环与 2x、3x 和 4x洗滤循环之间存在显著差异（分别为 p= 0.006、0.0001 和 3.2E-5）。在 4x至 10x 洗滤循环间未发现显著性 (p = 0.151, NS)。
图4. 初始红细胞 (RBC) 单元和10x 洗滤循环样本的氧平衡曲线 (OEC) (a)。使用切向流过滤 (TFF) RBC 漂洗系统处理了正好10 个 RBC 单元。初始 RBC 单位的OEC 显示为蓝色95% CI。最终 10 x 样本的 OEC显示为红色95% CI。来自 RBC 单元的初始样品和TFF 漂洗过程后的最终样品（10 x 洗滤循环）的 P50 值（b）（p = 0.0493，*）。来自 RBC 单元的初始样品和TFF 漂洗过程后的最终样品 (10 x 洗滤循环) 的希尔系数(n) (c) (p = 0.0493, *)。
总结来说，本研究提出了一种利用 TFF 的新型RBC漂洗技术，去除RBC 单元中的溶血副产物。本研究的主要目标是确定该系统在去除细胞外无细胞Hb 而不引起进一步细胞损伤方面的有效性。由于俄亥俄州立大学有可用的设备，洗涤前、后RBC 单元的定量和表征以无细胞 Hb 的存在为中心，暂不包括可用于表征 RBC 漂洗效果的分析方法或分析物的全部范围。虽然 TFF 与手动或自动 RBC 漂洗系统之间没有直接比较，但可以在本研究结果与文献结果之间进行比较。最近对RBC 漂洗技术的综述文章侧重于手动漂洗和开放式或封闭式自动漂洗系统，并比较RBC 单元内免疫原性成分的去除以及由此产生的长期储存影响。与手动和自动系统相比，本研究设计的TFF 系统可处理更高的漂洗溶液体积，但显示具有更优化的Hb 去除以及可比的 RBC 回收率。TFF 工艺的漂洗时间较长，部分原因是洗涤体积的增加。结果表明，在4个洗滤循环后可成功去除游离 Hb，从而有可能用于优化目前所使用的10个洗滤循环的标准数量。当前研究的一个主要缺点是关于TFF 漂洗过程后长期储存的信息有限。这项概念验证研究的重点是对RBC 单元漂洗前、后的直接比较，仅旨在验证TFF 工艺可以从过期的 RBC 单元中去除大部分无细胞 Hb。另一研究的初步数据显示，TFFRBC 漂洗系统在从未过期单元中去除无细胞Hb 方面同样有效，并获得了类似的结果。为了在TFF 系统和传统漂洗系统之间进行更完整的比较，需要在漂洗后进一步表征更多分析物，同时优化泵流速和背压调节，以改善潜在的工艺时间。尽管需要对RBC 装置的漂洗后储存进行更多研究，研究所设计的系统有可能彻底改变RBC 漂洗系统，部分原因在于其较小的物理占地以及可灭菌的组件。这使得该系统可以很容易地运输，以进行潜在的床边离体RBC 漂洗，并且通过实施无菌条件，可以允许直接输注漂洗后的RBC，以减轻来自离体储存导致的潜在免疫原性副产物增加的风险。
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原文：S.Lu, M.Allyn, M.Weigand, et al., Tangential flow filtration facilitated washing of human red blood cells: A proof-of-concept study. Vox Sanguinis, 2022,1–9.
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