探索传统小规模CHO补料分批的局限性，加速单抗按需生产
在治疗性抗体生产领域，补料分批策略的多样化形式正在蓬勃发展，以应对市场需求。所有生产方法都倾向于遵循普遍接受的提高滴度的“教条”，因为它直接增加生产产量。虽然滴度受生物量（表示为 IVCD）、培养时间和细胞特异性生产率 (qP) 的影响，但我们独立更改了这些参数中的每一个，以调整我们的工艺策略，从而使解决方案适应个别生产需求。为此，我们致力于提高 IVCD，作为实现高密度接种补料分批的能力。然而，由于设施操作模式的限制，强化补料分批可能并不总是可行，我们还通过添加特定的培养基添加物单独增加了 qP。与标准补料分批工艺相比，这两种策略在 14 天内将滴度提高了 100%，产品质量属性发生了适度且可接受的变化。由于强化补料分批可以与传统补料分批的细胞特异性生产力相媲美，因此我们开发了新的混合策略，以在不影响生产力的情况下实现可接受的接种密度，或者最大限度地提高生产力以缩短时间。
简介
随着具有不可预测的可制造性的非天然分子的出现，产生了越来越多的工业问题，蛋白质治疗行业必须不断创新。行业已经探索了许多生物工艺优化策略来提高单位体积生产率，同时保持较低的操作复杂性。单克隆抗体 (mAb) 从这些持续的努力中受益最大，以满足不断增长的市场需求，并降低生产成本
生物药的首选哺乳动物表达系统是中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)，因为它们能够进行接近人类的翻译后修饰、高效的蛋白质折叠以及实现高产率。在过去的 2 年中，CHO 中的mAb表达得到了极大的改善，现在可以在 14-18 天内实现 10 g/L 的单位体积滴度。这些滴度与 mAb 最主要的生产方法相关，即补料分批模式。
补料分批模式是一种简单的生产模式，其在基础培养基中添加含有营养物质的补液溶液，以支持生产阶段。它以其高 mAb 产量、可靠性、易于执行以及在工业规模的实施而广受认可。此外，可以优化多个参数，例如基础和补液培养基成分、补料策略、温度、pH 或工艺持续时间，以最大限度地延长细胞培养寿命并提高生产力。然而，由于对提高效率的需求不断增加，出现了其它替代性补料分批模式。由于实现了高接种密度，它们中的大多数被认为是补料分批工艺强化策略。最近的一个概念包括前期灌流（N-1），它允许通过细胞截留来稳定地积累生物质，从而提高生产生物反应器的接种密度（N）。它通过缩短工艺持续时间来缩短生产时间，或者在较小的生物反应器中提高最终收获滴度。有趣的是，这种混合运营模式对设施设计产生了适度的影响，因为它基于预先存在的工艺，而不是实施全新的技术。节省时间、空间和金钱是提高生产力的额外收益。
尽管在生产方面取得了这些巨大进步，但在早期阶段仍存在工艺优化，特别是早期生产。细胞系供应商处于药物开发的交界面。它们不仅通过选择高产克隆提供稳定的表达细胞系，而且还必须确保早期工艺转移。如果在这个阶段引入必要的灵活性，将有助于更好地满足药物生产的未来需求。但这必须考虑不同的因素。首先，合同制造组织 (CMO) 或设施设计中可用的支持技术等技术限制将影响最佳操作模式的选择。其次，要求加快时间线，以实现更快的管线交付，从而规避竞争对手或响应紧急大流行爆发的需求也可能决定适当的工艺选择。第三，根据临床应用，产品数量或质量可能会影响工艺模式或持续时间的选择。总而言之，尽早预测这些不同的需求变得至关重要，并且需要合适的早期工艺解决方案。
在这项研究中，我们旨在为细胞系开发带来这种开放性思维模式灵活性，以便能够适应早期的补料分批工艺解决方案。生物量（表示为活细胞密度积分，IVCD）和细胞的特异性生产力（qP）都与最终产品的滴度呈正相关。
（滴度 = qP × IVCD）。我们在 14 天内成功地实现了超过 10 g/L 的两种模式 mAb（mAbA 和 mAb B）的表达滴度，仅通过使用化学工程方法，达到50 × 106 cells/mL 峰值密度，以增加生物量，或通过改善 qP（40 pg/cell/day) 。此外，我们证明了 qP 的提高并没有以牺牲产品质量为代价，因为仅观察到产品质量属性的适度改变。基于这些发现，我们开发了最接近生产需求的新型混合策略，以在不影响生产力的情况下实现可接受的接种密度，或者最大限度地提高生产力，以缩短生产时间。我们的研究证明了该平台工艺参数不可否认的可塑性，并强调理解 mAb 开发的连续阶段是提供新的适应且按需 CHO 补料分批早期工艺解决方案的关键决定因素。
详细实验操作和结果讨论，请参考原文。
图1. 以生物量显示的补料分批工艺性能。VCD 和活性 (a)、特异性生产率 (b)、谷氨酰胺(c)、谷氨酸 (d)、乳酸 (e) 和氨 (f) 曲线，表达 mAb A的标准补料分批以起始接种密度 0.45 ± 0.1 × 106 cells/mL（n = 14，黑色实线，浅灰色阴影表示SD ）接种，以及高密度接种补料分批，起始接种密度为 10 ± 1.7 × 106cells/mL（n = 2，黑色虚线，深灰色阴影表示SD）。
图2. 以qP 显示的补料分批性能。VCD和活性(a)、特异性生产率(b)、谷氨酰胺 (c)、谷氨酸(d)、乳酸(e)和氨(f)曲线， 表达 mAb B的标准补料分批以起始接种密度 0.45 ± 0.1 × 106 cells/mL（n = 3，黑色实线，浅灰色阴影表示SD ）接种，无添加，以及中等接种密度补料分批，起始接种密度为 1 ± 0.2 × 106cells/mL，并添加醋酸铜和柠檬酸铁（n = 5，黑色虚线，深灰色阴影表示SD）。
图3.不同强化工艺的生产力表现。与初始标准补料分批（黑色实线）相比，显示4种强化工艺的 mAb B qP（虚线）。
图4. 强化工艺对不同 CHO-M 生产细胞系特异性生产率的影响。CHO-M 生产细胞系表达不同性质的蛋白质：mAb、Fc 融合蛋白、双特异性抗体和难以表达的蛋白质（qp < 2 pg/cell/day），显示标准和中等接种添加补料分批的特异性生产率数据。p 值小于 0.0001，按照传统标准，工艺之间的 qp 差异在统计上被认为非常显著。
图5. 不同起始密度的添加补料分批性能。初始接种密度1、2、3、4和10 × 106 cells/mL，添加乙酸铜和柠檬酸铁的5种表达mAb a的补料分批工艺的VCD和活性(a)以及特异性生产力(b)。
表2.全部高接种添加补料分批工艺mAb A 和 mAb B 产品质量属性比较
图6. 提高生产力的关键决定因素的示意图。特异性蛋白质产量 (qP) 是在规定的生产时间（本研究中从第 6 天到第 14 天的生产时间）内蛋白质生产速率的量度。qP 由蛋白质浓度vs. IVCD 曲线的线性斜率确定。
图7. 强化补料分批工艺性能对滴度和时间的影响。标准补料分批、中等接种密度添加补料分批和高接种密度添加补料分批工艺之间第 7 天、第 10 天和第 14 天 mAb B 收获滴度的比较。
讨论
工艺开发已成为生物治疗药物开发过程中研究的关键阶段。了解可能影响细胞培养性能和最终质量属性的因素同样重要。在本研究中，我们开发了一系列补料分批培养模式，以提供按需工艺解决方案。
从以添加物添加为导向的方法到强化培养模式，我们证明这些工艺不是 CHO 克隆特异性和蛋白质产品特异性，而是适用于任何生产细胞系的通用解决方案。我们不同的工艺操作条件可实现高细胞特异性生产力，滴度高于 10 g/L，同时在 14 天的生产时间内保持高活细胞密度。我们发现，将初始接种密度提高到阈值以上可以加快增殖速度以获得更高的生物量，并且我们通过微调此工艺参数，成功地加强了对细胞需求的控制。此外，我们的研究表明，无论所选工艺的持续时间如何，所选添加物的“智能”补液方案都能最大限度地提高产品产量，而不会影响产品质量。然而，在比较传统的补料分批工艺与中等接种添加补料分批工艺时，观察到了一些产品质量属性的变化。尽管 mAb A 的高分子量物质增加达 4.4%，但仍处于低水平。这在工艺开发的早期阶段并不被认为是关键的，并且可以通过随后的纯化和工艺步骤大大减少。与电荷异构体有关的其它变化被突出显示并可能与分析和工艺可变性有关。在商业开发过程中也观察到了后一种情况，并且没有报道显示会影响治疗性 mAb 的功效和安全性。
总体而言，本研究最重要的发现是在选择补料分批模式、以适应生产需求方面的灵活性概念。首先，通过保持典型的补料分批操作模式，我们摆脱了在合同制造组织中寻找合适的支持技术的“义务”。其次，如果空间是一个主要问题，我们仍然可以从可能需要大型生物反应器的传统补料分批模式转变为替代的高接种密度补料分批模式，从而减少设备占用空间。简而言之，便利的工艺转移应该让事情变得简单，并且应该能够在仅做微小变化的情况下，适合任何工厂组织，而不是面临技术工艺限制或设计。
随后，我们研究了生物量与工艺持续时间之间的关系，以确定这些因素之间对成功生产贡献最大的阈值。为此，我们以不同的接种密度进行培养，0.45、1、2、3、4 和 10 × 106cells/mL。
了解所选适应症所需的产品量、最终产品的稳定性或其对宿主细胞的内在生产毒性，可以考虑适当的细胞接种以及工艺持续时间。2000 L 生物反应器中的临床生产批次通常以 < 0.5 × 106cells/mL 接种，细胞以补料分批模式生长。以 10 × 106 cells/mL 的密度接种可能需要使用创新技术（例如 N-1 阶段的 ATF 灌流系统）增强扩增前阶段。然而，对于大于 10,000 L 的大型商业化生产生物反应器，它可能不在考虑范围之内，因为预选的生产设施在操作上无法实现。鉴于最高细胞密度峰值为 50 × 106 cells/mL 的 CHO-M 细胞系较高的增殖率，可以考虑 N-1 补料分批培养在第6天以10X 稀释接种 10,000 L 生物反应器。另一个需要考虑的重点是时间线。在新药上市的高风险竞争中，加快生产时间线可能是规避竞争对手的决定性因素，并且比生产力和成本更具战略意义。在细胞系开发的早期阶段选择一个适应的短工艺可以避免之后引入变化，这是有风险的，甚至是耗时的。在这项研究中，我们证明了当使用 10 × 106 cells/mL 作为接种液时，第 7 天的滴度可以增加 4.5 倍，其性能和质量与传统补料分批的 14 天运行时间相当。这种更快的工艺，可以产生多克的滴度，从而节省时间并降低成本。它不仅可以加快管线交付速度，还可以改善设施使用管理，同时提高生产批次的吞吐量。该工艺将根据药物开发人员的考虑进行相应调整。因此，可以通过稍微增加工艺时间或降低接种密度来调整它，以更好地适应组织或商业利益，而不会影响效率输出，如研究所示。
生物生产正在快速发展，灵活性可能是未来的关键决定因素。通过在细胞系开发道路上尽快提供按需工艺解决方案，而不施加技术限制，我们正在通过预测需求，而不是推广即用型专用工艺，来修改生产方法。
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原文：A.Mahe, A.Martine, S.Fagete, et al., Exploring the limits of conventional small‑scale CHO fed‑batch for accelerated on demand monoclonal antibody production. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2022, 45:297–307.
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