基因治疗药物设计专题 | sgRNA设计方法及靶基因细胞敲除的应用

基于CRISPR经典的基因敲除系统包含sgRNA序列和Cas蛋白，sgRNA序列长度一般为20个核苷酸。常用于DNA双链切割活性的Cas蛋白包括Cas9和Cas12。由于不同Cas蛋白识别的PAM序列，切割效率及特异性不同，本文将以Cas9蛋白为例详细介绍sgRNA的设计，质粒构建及细胞敲除过程。

1.sgRNA设计

1.1 基于基因名称的sgRNA设计

可通过将基因的名称提交给在线软件完成，目前常用的仅通过输入基因名称就可完成sgRNA设计的在线工具有CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no/)[1]，CRISPick(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)[2-4], 和TKOv3(https://crispr.ccbr.utoronto.ca/crisprdb/public/library/TKOv3/)[5,6]。下面我将以CHOPCHOP软件为例简要介绍其sgRNA设计的具体流程。

（1）首先登录CHOPCHOP软件，在Target菜单输入基因名称如TBK1,之后选择合适的物种如‘Homo sapiens’，所用Cas蛋白选择‘CRISPR/Cas9’,sgRNA设计目的选择‘Knockout’,最后选择‘FindTarget Sites’（Figure1）。在选择完基因名称后，需要根据细胞或组织类型选择合适的转录本。

Figure1

（2）CHOPCHOP运行结束后，将根据sgRNA的切割DNA效率及潜在脱靶情况进行排序（MM0 = 0 mismatches, MM1 = 1 mismatch, MM2 = 2mismatches, MM3 = 3mismatches），我们一般选择切割效率较高且脱靶可能性较低的sgRNA序列，另外由于Cas9在sgRNA引导下可切割双链DNA，并通过造成基因移码突变起到敲除基因的作用；因此，sgRNA序列尽量靶向靠近基因起始密码子ATG下游，最好位于第一或第二外显子上（Figure2）。一般根据上述设计标准，选择2~3条sgRNA进行后续验证。

Figure 2

1.2 基于基因序列的sgRNA设计

通过输入目标基因序列进行sgRNA序列设计具有更多的灵活性，例如可针对内含子和启动子等基因非编码区域设计，满足上述要求常用的设计软件包括Cas-Designer(http://www.rgenome.net/cas-designer/)和CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)[7,8]，下面我将以Cas-Designer为例简要介绍该软件的应用方法。

（1）进入Cas-Designer界面后，首先选择Cas类型，软件将根据此确定Cas蛋白识别的PAM序列以选择合适的sgRNA，此处我们可选择SpCas9,其PAM序列为NGG(Figure 3)。

Figure 3

（2）将目标序列如FANCM-EXON2以FASTA格式输入，并选择sgRNA长度，由于不同Cas蛋白的所需sgRNA序列长度不同，我们在此可选其默认长度。例如SpCas9蛋白的sgRNA序列长度为20个核苷酸。另外，我们可根据需要选择合适的物种如HomoSapiens后,点击‘Submit’提交(Figure 4）。

Figure 4

（3）主要根据“Out-of-frameScore”和“Mismatches”选择合适sgRNA序列，一般sgRNA序列的Out-of-frameScore需大于66，其在基因组中有2个Mismatches的数目应小于2。除此之外，sgRNA中不要出现4个或以上联系“T”核苷酸，以防sgRNA转录终止(Figure5)。基于此我们可通过输入FANCM-EXON2序列：ggtctacacaagcttccaccaggaaggaaatatggtgcagtaagagagtgctttttcttacacctcaggtcatggtaaatgacctttctagaggagcttgtcccgctgctgaaataaagtgtttagttattgatgaagctcataaagctctcggaaactatgcttattgccag。选择候选sgRNA序列如AGGTCATTTACCATGACCTG，ATGGTAAATGACCTTTCTAG和CGGGACAAGCTCCTCTAGAA。值得注意的是当sgRNA第一个碱基为A、C或T，可在sgRNA第一个碱基前面加g以提高sgRNA的转录效率。

Figure 5

（4）SpCas9所需sgRNA为不包括“NGG”的20个碱基序列。由于SpCas9具有潜在脱靶效应，研究人员目前通过SpCas9蛋白氨基酸点突变的方式构建了SpCas9的各种突变体以提高SpCas9的特异性，其不同突变体特异性高低为evoCas9>> HypaCas9 ≥ SpCas9-HF1 ≈ eSpCas9(1.1) >xCas9 > Sniper-Cas9 > SpCas9，而其相应的DNA切割活性高低为SpCas9 ≥ Sniper-Cas9 > eSpCas9(1.1)> SpCas9-HF1 > HypaCas9 ≈ xCas9 >>evoCas9[9]。为更好的选择合适的sgRNA和SpCas9突变体组合，我们可利用DeepSpCas9variants（http://deepcrispr.info/DeepSpCas9variants/），验证上述选择sgRNA序列在何种SpCas9突变体中可同时确保较高的切割特异性和有效性[9]。例如，当我们输入FANCM-EXON2序列后发现靶向FANCM的sgRNA:AGGTCATTTACCATGACCTG，ATGGTAAATGACCTTTCTAG和CGGGACAAGCTCCTCTAGAA，依然在Sniper-Cas9有较高的切割活性。由于Sniper-Cas9比SpCas9特异性高，为此我们可以选择Sniper-Cas9与上述sgRNA联用进行基因敲除。

2．sgRNA载体构建

sgRNA可构建到LentiCRISPRv2 (https://www.addgene.org/52961/) 或lentiGuide-Puro(https://www.addgene.org/52963/)载体中，LentiCRISPRv2慢病毒载体包含Cas9蛋白因此可直接用于敲除实验，lentiGuide-Puro慢病毒载体不含Cas9蛋白，因此该载体需转入到已表达Cas9蛋白的细胞中，其携带的sgRNA方可发挥作用。sgRNA构建到上述载体的详细步骤可参照张峰课题组的protocol（https://media.addgene.org/data/plasmids/52/52961/52961-attachment_B3xTwla0bkYD.pdf）。载体构建完成可用U6promoter 通用引物进行测序，验证sgRNA是否成功插入载体。

3.病毒包装和细胞感染

LentiCRISPRv2 或lentiGuide-Puro慢病毒包装方法可参照addgene提供的protocol（https://www.addgene.org/protocols/lentivirus-production/）进行。慢病毒生产所需包装细胞为293T，所需病毒包装辅助载体为psPAX2（https://www.addgene.org/12260/）和pMD2.G(https://www.addgene.org/12259/)。将收集的病毒利用addgene提供的protocol（https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines/）对目的细胞进行感染并用抗生素（如puromycin）对阳性细胞进行筛选,筛选出的阳性细胞一般需要继续培养7天以确保sgRNA可将目的基因敲除。

4.基因敲除鉴定及单细胞克隆筛选

基因敲除效率可以用westernblot进行鉴定，或通过提取细胞基因组DNA利用3引物PCR的方法进行验证(Figure6)[10]。由于sgRNA介导的基因敲除主要通过移码突变，因此敲除效率验证一般不用基于mRNA的PCR方法。若在转染sgRNA和Cas9的混合细胞中，经验证发现其基因敲除效率较高。为消除细胞的异质性，可对混合细胞进行单克隆筛选。单细胞克隆筛选可采用极限稀释或流式分选的方法，可参照Corning或 Invitrogen公司提供的具体实验方法操作进行（https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/genome-editing/genome-editing-learning-center/genome-editing-resource-library/crispr-validated-protocols/guidelines-clone-isolation-validation.html）或（https://www.corning.com/catalog/cls/documents/protocols/Single_cell_cloning_protocol.pdf）。由于sgRNA可造成基因组永久性片段缺失，因此也可将具有较高切割效率的sgRNA片段连接到具有荧光标记且表达Cas9的载体上（如pSpCas9(BB)-2A-GFP（https://www.addgene.org/48138/）），随后将上述载体瞬时表达到目的细胞，进而通过流式细胞分选将高表达GFP的单细胞分选出来，经扩增培养及基因敲除鉴定以获取敲除效率较高的单细胞克隆。由于该方法是通过瞬时表达CRISPR/Cas9元件，因此经长时间细胞培养后，细胞将不在含有Cas9蛋白及sgRNA序列。

Figure 6

5.恢复实验

由于sgRNA具有潜在的脱靶效应，为确保目的基因的敲除表型并非脱靶效应导致，除设计多条有敲除效果的sgRNA进行验证外；一般还会通过慢病毒感染的方式恢复目的基因的表达，以观察基因敲除所导致的相应表型是否会被逆转。（1）若敲除细胞是通过慢病毒感染CRISPR/Cas的方法获得，其进一步通过慢病毒重新转入的目的基因的序列中，其被sgRNA识别的碱基序列需要进行同义替换，或同义突变sgRNA识别所需的PAM序列；通过上述方法，敲除细胞原有的CRISPR/Cas9元件将不会识别过表达的基因序列，进而使敲除的基因表达恢复。（2）若敲除细胞是通过瞬时表达荧光标记的CRISPR/Cas载体获得，那么慢病毒携带的目的基因片段则无需进行任何同义替换。

总结

基于sgRNA的基因敲除方法与shRNA或siRNA方法相比序列脱靶性明显降低，尽管sgRNA作用时间稍长（一般需要1周左右）[11]；但sgRNA能够造成基因永久性敲除，因此适用于基因敲除细胞的构建。由于通过慢病毒递送CRISPR元件获得的敲除细胞系含有Cas蛋白，因此需要构建相应的对照细胞系,另外为确保敲除效率，针对某一基因一般可设计2~3条不同的sgRNA。除此之外，基因敲除表型最好需要至少2个有敲除效果的sgRNA进行验证。

上述基于基因序列的sgRNA设计方法除可用于基因敲除外，还可用于dCas9介导的基因激活、抑制和表观遗传学修饰等所需sgRNA序列。另外，也可通过设计两条sgRNA，利用nCas9（nickaseCas9）实现DNA片段的删除，插入和碱基位点的替换。Cas9具有两个切割活性中心-RuvC和HNH，负责双链DNA的切割。RuvC突变体Cas9(D10A)仅在靶向链上产生切口，而HNH突变体Cas9(H840A)仅在非靶向链上产生切口；nCas9是Cas9(D10A)或Cas9(H840A)。然而利用两条sgRNA和nCas9介导的DNA片段插入和碱基位点突变依赖于同源重组修复（Homologydirectedrepair），而此过程主要发生在分裂细胞的G2期和S期，因此该方法无法对完全分化的细胞如神经细胞，心肌细胞和骨骼肌细胞实现上述基因编辑。但碱基编辑器和先导编辑器的发现可突破上述传统编辑器的限制。

本文作者烟雨平生邮箱：[e-mail]，欢迎交流。

参考文献

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6. Mair,B., et al., Essential gene profiles for human pluripotent stemcells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.2019. 27(2): p. 599-615. e12.

7. Park,J., S. Bae, and J.-S.J.B. Kim, Cas-Designer: a web-based tool forchoice of CRISPR-Cas9 target sites. 2015. 31(24): p.4014-4016.

8. Concordet,J.-P. and M.J.N.a.r. Haeussler, CRISPOR: intuitive guide selectionfor CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. 2018.46(W1): p. W242-W245.

9. Kim,N., et al., Prediction of the sequence-specific cleavage activityof Cas9 variants. 2020. 38(11): p. 1328-1336.

10. Shah,A.N., et al., Rapid reverse genetic screening using CRISPR inzebrafish. 2015. 12(6): p. 535-540.

11. Ran,F., et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.2013. 8(11): p. 2281-2308.

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