Science︱周晓明等揭示蛋白低复杂度序列中致病遗传突变通过增强局部动态相互作用影响蛋白正常功能

撰文︱周晓明

责编︱王思珍

编辑︱杨彬伟

蛋白低复杂度结构域（low complexity domain，LCD）在生物体内广泛存在，且具有重要的生物学功能。例如核孔蛋白的FG序列形成核孔的中央选择性渗透性屏障；中间纤维蛋白的头部无序区域帮助中间纤维细胞骨架正确组装；众多核酸结合蛋白的无序区域通过其相分离或相变功能参与各种生物学功能特异的无膜细胞器（membraneless organelle）或生物分子凝聚体（biomolecular condensate）的形成等。同时，LCD也与诸多神经系统疾病和癌症的发生紧密相关。长期以来，LCD因未能在正常生理状态下形成稳定的三维结构而一直被认为处于无结构或无序状态，为固有性无序域（intrinsically disordered region，IDR）。然而，关于LCD如何在体内完成正常生物学功能以及从正常生理状态转变到疾病状态的分子机制仍有疑问。

2022年6月30日，美国德克萨斯大学西南医学中心Steven McKnight教授课题组在Science上以长文形式发表了题为“Mutations linked to neurological disease enhance self-association of low complexity protein sequences”的文章。周晓明博士为论文第一作者，Steven McKnight教授和Glen Liszczak教授为文章共同通讯作者。文章主要阐述了蛋白低复杂度无序区能够通过形成局部动态cross-b结构发挥其生物学功能，并且揭示了蛋白无序区中致病突变导致蛋白功能异常的分子机理。同时Science期刊也特别邀请了生物化学学家、美国四院院士Gregory Petsko教授和神经生物学家Scott Small教授为该文章撰写了题为“Elucidating the causes of neurodegeneration”的评注性文章。

Steven McKnight教授课题组长期致力于研究蛋白低复杂度结构域参与生物学功能及其导致疾病发生的分子机制。该课题组及领域内许多科学家都发现，许多蛋白的LCD需要通过自相互作用（self-association）来完成其生物学功能，并且在体外研究中这些LCD能够形成cross-b结构。

在此研究中，作者首先以RNA结合蛋白TDP-43为研究对象，尝试理解其LCD形成相分离的分子机理。TDP-43是一个典型的通过其LCD相分离功能在细胞内形成功能性RNA颗粒（RNA granule）和在体外形成相分离液滴（liquid-like droplet）的蛋白。同时，TDP-43 LCD相互作用发生异常时也会导致神经退行性疾病。McKnight实验室在之前的研究中，作者通过测定TDP-43 LCD上不同位置的甲硫氨酸对于H₂O₂氧化的敏感程度差异，定位了一段在进化上高度保守、对相分离功能至关重要并在相分离发生后被保护的核心区域（此区域中的甲硫氨酸不易被H2O2氧化）[1]。与许多其它蛋白的LCD形成的相分离亚细胞结构性质相似，TDP-43在体内形成的RNA颗粒以及在体外形成的相分离液滴具有液体属性（liquid-like），提示了LCD之间特异但又动态可逆的相互作用性质。据此，作者提出猜想：TDP-43 LCD相分离核心区域或许形成了动态的cross-b的结构来实现LCD之间的自相互作用。而验证此猜想所面临的首要问题是如何测定TDP-43 LCD相分离时的动态结构。因为现有的任何蛋白结构解析和测定方法都需要蛋白形成稳定结构，或是不能兼容相分离蛋白样品。为了避开这些直接测定结构方法的限制，作者将目光聚焦于形成蛋白二级结构所必需的肽主链间氢键作用。作者通过引入非天然氨基酸，利用多肽合成和化学链接等技术，建立了能够在不改变蛋白其它性质的前提下阻断特定氨基酸位点处肽主链间氢键作用的通用型方法（图1）。作者利用此方法系统性地筛查了TDP-43 LCD相分离核心区域中每个氨基酸位点处形成肽主链间氢键作用对于相分离功能的影响。结果显示，有些氨基酸位点处单个肽主链间氢键作用的缺失就能显著削弱TDP-43 LCD的相分离能力，而且这样的氨基酸位点都连续集中于一小段局部区域（图2）。此结果不仅准确定位了一段需要形成肽主链间氢键作用网络来完成TDP-43 LCD相分离功能的局部区域，还直接证明了蛋白结构介导了TDP-43 LCD发生相分离时的特异性自相互作用。

图1 在全长LCD的特定位点处引入非天然氨基酸的技术路线示意图

（图源：X.M. Zhou, et al., Science, 2022）

此外，作者也通过甘氨酸突变筛查评估了相分离核心区域中每个氨基酸侧链间的作用力对于TDP-43 LCD相分离功能的影响。结果显示，对于相分离功能重要的侧链间相互作用区域与主链间相互作用区域高度重合。削弱主链间的氢键作用降低了TDP-43 LCD 形成liquid-like droplet的能力或形成的liquid-like droplet的稳定性，而改变侧链间的作用后则导致了liquid-like droplet形态异常或发生聚集。此结果显示肽主链间的作用力和氨基酸侧链间的作用力共同形成了特异的局部动态结构。

图2 TDP-43 LCD相分离核心区内每个氨基酸位点处，肽主链间氢键作用的缺失对相分离能力的影响

（图源：X.M. Zhou, et al., Science, 2022）

在甘氨酸突变筛查实验中，作者意外发现位于相分离核心区域中的脯氨酸（P320）对于TDP-43 LCD的相分离功能极其重要。当脯氨酸（P320）突变成其它氨基酸后都会导致蛋白发生严重聚集，摧毁了TDP-43 LCD的正常相分离功能。而突变位于相分离核心区域之外的其它脯氨酸对于TDP-43 LCD正常相分离功能无任何影响。严重聚集的行为提示了TDP-43 LCD之间异常增强的相互作用，此脯氨酸突变造成的影响甚至远大于位于TDP-43 LCD上的神经退行性疾病致病突变体M337V。作者尝试了在培养的细胞内表达此脯氨酸突变体，发现其导致了细胞死亡，这也解释了为何人类遗传学研究未能在疾病中发现此脯氨酸位点突变体。脯氨酸是一个性质特殊的天然氨基酸，它特殊的环形侧链阻断了其氨基作为氢键供体参与形成肽主链间的氢键作用力。除此之外，脯氨酸的特殊性还在于其特殊的刚性几何构象和形成肽键时即能形成cis-构象也能形成trans-构象以及能在两种构象间转换。作者实验发现，当用非天然氨基酸阻断突变体位点处的主链间氢键作用后，TDP-43 LCD恢复了形成相分离液滴的功能，说明TDP-43 LCD利用了脯氨酸不能形成肽主链间氢键的性质来平衡LCD之间的动态相互作用。

由于受到TDP-43 LCD上脯氨酸特殊重要性的启发，作者调研了人类遗传学研究，发现在蛋白固有性无序区（intrinsically disordered region, IDR）中，特定脯氨酸位点发生突变后导致疾病发生的现象较为普遍，并且这些脯氨酸位点突变体的病理特征具有一定的相似性，即它们也都导致了蛋白因异常增强的相互作用而形成聚集。因此，作者想探究其它蛋白无序区中脯氨酸位点的致病突变体导致蛋白功能失常的分子机理。作者选取了神经细胞中的中间纤维细胞骨架蛋白neurofilament light、通过相分离功能参与细胞内RNA granule形成的蛋白hnRNPA2和微管相关蛋白tau作为研究对象。作者在此前的研究中发现neurofilament light蛋白的头部无序区通过以动态结构为基础的特异性自相互作用来帮助中间纤维细胞骨架正确组装，并且通过蛋白翻译后修饰阻断无序区之间的相互作用来实现中间纤维在细胞内的可控解聚。导致退行性疾病的脯氨酸位点（P8和P22）突变体都异常地增强了头部无序区之间的自相互作用[2]在作者之前的另一研究中，作者通过固态赫兹共振方法鉴定了hnRNPA2 LCD形成cross-b相互作用的核心区域[3]。位于此核心区域的疾病相关突变体（D290V和P298L）已被证明能够明显增强LCD之间的自相互作用。关于tau蛋白与神经退行性疾病之间的密切关系已有广泛研究，其致病突变体P301L/S/T也被发现都能够增强tau蛋白聚集的形成[4]。在此研究中，作者利用非天然氨基酸抑或阻断致病突变位点处肽主链间氢键作用，抑或干扰脯氨酸cis-或trans-构象，从而研究了共计10个来自上述三个蛋白的脯氨酸位点致病突变体的致病机理。实验结果再次显示，阻断致病突变位点处的单个肽主链间氢键便可恢复蛋白的正常功能，这也再次说明这些蛋白利用脯氨酸来阻断连续的主链间氢键作用网络。当脯氨酸被突变后而导致额外的肽主链间氢键作用时，便会显著增强蛋白的自相互作用（图3）。

图3 蛋白LCD无序区中处于动态平衡中的局部cross-b结构

（图源：X.M. Zhou, et al., Science, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，作者为研究蛋白无序区之间动态可逆的相互作用分子机制，建立了特异性阻断肽主链间单个氢键作用的蛋白半合成通用型方法，并且通过此方法发现蛋白无序区之间可通过局部区域形成动态结构来完成其生物学功能。此外，作者也鉴定了位于蛋白自相互作用区域的脯氨酸对于保持结构动态特性的重要性以及脯氨酸位点致病突变体改变蛋白正常功能的分子机理。人体约20%左右的蛋白含有长段无序区。作者实验室的研究所涉及的不同蛋白无序区都采用了相似的分子机制实现特异性相互作用，但其功能涉及了生物相分离[1, 3]、细胞骨架组装[2]以及核孔中央屏障形成[5]等在内的多个生物学过程。因此，作者推测细胞内还有很多固有性无序的蛋白序列通过类似的分子机制参与了种类丰富的生物学过程。

蛋白无序区与人类退行性疾病和癌症发生密切相关，但在此篇文章中还未涉及任何基于作者发现的疾病治疗策略探索。这也许是一个包括作者实验室在内的领域内科学家将来共同探索的方向。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abn5582

第一作者周晓明（左），通讯作者Steven McKnight（中），通讯作者Glen Liszczak（右）

（照片提供自：Steven McKnight /Glen Liszczak团队）

人才招聘
【1】人才招聘︱“ 逻辑神经科学 ”诚聘文章解读/撰写岗位 ( 网络兼职, 在线办公)

往期文章精选【1】J Neuroinflammation︱曹嵩课题组揭示激活蓝斑-脊髓去甲肾上腺素能神经元通过减少脊髓背角神经炎症缓解小鼠疼痛【2】STTT︱金力/邹云增/李立亮合作揭示1型大麻素受体拮抗剂减轻抗精神病药诱导的心肌焦亡及毒性【3】Nat Neurosci︱突破！钾通道视紫红质是介导光遗传学抑制的天然光门控钾通道【4】Acta Neuropathol︱陈础课题组揭示创伤性脑损伤促进阿尔茨海默病发展的关键因子【5】Neurosci Biobehav Rev︱唐向东团队探索PTSD夜间梦魇的药物治疗与心理治疗疗效【6】Cell Biosci︱易立涛/朱继孝团队合作揭示IL-1R/C3aR通路调控抑郁症突触修剪的作用机制Neurosci 【7】Cereb Cortex︱王群/胡文瀚/王茜团队合作揭示受言语可懂度调控的两阶段听皮层加工机制【8】Mol Neurobiol︱刘振华课题组揭示DNAJ家族基因在帕金森病中的作用【9】Nat Neurosci︱表征研究突破！疼痛个体的大脑表征差异【10】Front Aging Neurosci︱樊东升团队聚焦NK细胞在帕金森病中的病理作用

优质科研培训课程推荐【1】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会 8月6-7日 腾讯会议

参考文献（上下滑动阅读） 

[1]  Lin, Y., Zhou, X., Kato, M., Liu, D., Ghaemmaghami, S., Tu, B.P., and McKnight, S.L. (2020). Redox-mediated regulation of an evolutionarily conserved cross-beta structure formed by the TDP43 low complexity domain. Proc Natl Acad Sci U S A 117, 28727-28734. 10.1073/pnas.2012216117.

[2] Zhou, X., Lin, Y., Kato, M., Mori, E., Liszczak, G., Sutherland, L., Sysoev, V.O., Murray, D.T., Tycko, R., and McKnight, S.L. (2021). Transiently structured head domains control intermediate filament assembly. Proc Natl Acad Sci U S A 118. 10.1073/pnas.2022121118.

[3]  Murray, D.T., Zhou, X., Kato, M., Xiang, S., Tycko, R., and McKnight, S.L. (2018). Structural characterization of the D290V mutation site in hnRNPA2 low-complexity-domain polymers. Proc Natl Acad Sci U S A 115, E9782-E9791. 10.1073/pnas.1806174115.

[4] Chen, D., Drombosky, K.W., Hou, Z., Sari, L., Kashmer, O.M., Ryder, B.D., Perez, V.A., Woodard, D.R., Lin, M.M., Diamond, M.I., and Joachimiak, L.A. (2019). Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nat Commun 10, 2493. 10.1038/s41467-019-10355-1.

[5] Shi, K.Y., Mori, E., Nizami, Z.F., Lin, Y., Kato, M., Xiang, S., Wu, L.C., Ding, M., Yu, Y., Gall, J.G., and McKnight, S.L. (2017). Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A 114, E1111-E1117. 10.1073/pnas.1620293114.

本文完