Ann Neurol︱陈忠/平渊团队揭示运用CRISPR技术特异性上调KCC2在难治性癫痫中的作用及机制
癫痫是一种常见的神经系统疾病，其特征是过度的超同步活动[1]，困扰了全球近1%的人口，并有近1/3的患者症状无法被抗癫痫药物控制而发展为难治性癫痫。目前有多种机制来解释癫痫耐药的神经生物学基础，包括药物靶点假说、药代动力学假说、神经网络假说、基因变异假说等[2]。然而，癫痫耐药性的发生机制仍不明确，药物治疗的局限性也给难治性癫痫患者的治疗带来了重大挑战，因而迫切需要更深入地了解癫痫耐药的确切机制和新的治疗方法。
2023年4月4日，浙江大学/浙江中医药大学的陈忠/平渊团队在Annals of Neurology 杂志在线发表了题为“CRISPR-based KCC2 upregulation attenuates drug-resistant seizure in mouse models of epilepsy”的研究论文。陈忠团队长期从事癫痫的发病机制研究与药物靶点的发现，课题组前期重点关注以海马下托为核心的神经环路“兴奋-抑制”平衡机制及药物靶点发现与研究（Neuron, 2017；Ann Neurol, 2019，2021； Biol Psychiat, 2020；Nat Nanotech, 2020；Nat Commun, 2020, 2022a，b； iScience, 2022；Sci Adv, 2022）。本研究论文采用了快速电点燃模型、海人藻酸诱导癫痫持续状态模型及海人藻酸诱导慢性自发模型，并结合地西泮或丙戊酸钠等经典抗癫痫药物，首次运用CRISPR技术在体内特异性上调下托KCC2明确其在难治性癫痫中的重要作用；并采用钙信号揭示了上调KCC2通过部分恢复受损的抑制性神经元功能来提高抗癫痫药物的治疗效率，为临床治疗难治性癫痫提供了新的靶点和思路。（拓展阅读：陈忠课题组研究进展，详见“逻辑神经科学”报道：本文末【特别专栏】）
目前越来越多的观点认为癫痫是由于脑内“兴奋-抑制”失衡而导致的发作，大部分经典抗癫痫药物都是通过增强抑制性神经元功能或抑制兴奋性神经元功能而起到抗发作效果。课题组前期研究发现癫痫反复发作会引起下托氯稳态失衡，氯稳态失衡会导致抑制性神经元GABA由经典的“超极化”作用向“去极化”转变[3]，而这种转变很可能引起一些以增强GABA功能为药理学基础的抗癫痫药物产生耐药性，因而调控下托氯稳态很可能是难治性癫痫治疗的关键。K-Cl协同转运蛋白异构体2 (KCC2) 是主要的阳离子-氯协同转运蛋白之一，通过挤压Cl-来维持胞内低氯浓度，从而通过GABAA受体使氯内流建立超极化信号。KCC2作为神经元兴奋性的关键调节因子，与许多生理功能和神经系统疾病(包括癫痫)相关。在癫痫中，KCC2的表达通常失调，导致兴奋性神经元中Cl-稳态的破坏，并促进去极化的GABA能信号[4,5]。越来越多的观点认为增强KCC2的活性可以通过促进Cl-排出而恢复受损的GABA抑制功能来治疗药物难治性癫痫[6]，提示KCC2是一个很有前景的治疗靶点。然而目前特异性KCC2激动剂选择还比较局限，尽管有一些被开发用于治疗耐药性癫痫，但使用这些激动剂进行药物干预是否对KCC2具有特异性且无副作用仍存在争议[7,8]。本研究运用CRISPR技术从内源性角度特异性激活下托KCC2的表达及其功能，并在各种动物模型中结合给药验证了调控KCC2在难治性癫痫中的治疗潜力。
图1 CRISPRa/dSaCas9载体设计和细胞培养的体外效率验证
(图源：Shi et al., Annals of Neurology, 2023)
首先，研究者们在dCas9-SAM25的基础上构建了一个dSaCas9-SAM系统，来激活内源性基因位点KCC2的高效转录。为了将大尺寸的dSaCas9-SAM系统递送到兴奋性神经元，研究者们使用念珠菌Nostoc punctiforme (Npu)来源的自断裂内含肽（split-intein）系统将dSaCas9-SAM分成氮端和碳端两部分装载到双AAV载体(称为AAV-N-dSaCas9和AAV-C-dSaCas9)(图1a)。随后，研究者们先在ND7/23细胞和初级神经元中验证了该转录激活系统的效果。当仅转染AAV-N-dSaCas9或AAV-C-dSaCas9时，均未能形成全长的dSaCas9反式激活子。只有当AAV-N-dSaCas9和AAV-C-dSaCas9两部分共转染时，细胞中同时转染的报告基因Target-mCherry才会出现的红色荧光（图1b）。研究者们也通过流式细胞仪分析了mCherry的被激活效率(图1c)。对于内源性基因的激活，研究者们测试了两个不同的靶向KCC2启动子区域的Sa sgRNA，以获得一个更高效的Sa sgRNA(KCC2- T1)来激活ND7/23细胞中KCC2的表达(图1d)。这些数据表明，dSaCas9-SAM系统能够有效地激活内源性KCC2基因的转录和表达。
图2 上调KCC2减轻海马癫痫发作严重程度
(图源：Shi et al., Annals of Neurology, 2023)
接着研究者们采用小鼠海马快速电点燃模型，在小鼠完全点燃后，通过引导套管将病毒AAV-N-dSaCas9和AAV-C-dSaCas9(dSa)注射到小鼠的下托。首先研究者们利用免疫印迹验证病毒dSa在小鼠体内确实上调KCC2的表达 (图2b)，然后分别在病毒表达2周和4周时，通过点燃小鼠后观察发作等级、后放电持续时间ADD和大发作持续时间GSD验证了上调KCC2显著减轻大发作的严重程度(图2c-e, i-k)。研究者们通过脑电能谱分析发现当病毒表达4周时，γ频率波段的脑电能量显著减少(图 2n)，而γ频段与GABAA受体功能相关，提示我们上调KCC2减轻癫痫发作严重程度可能与GABAA受体功能相关。这些结果表明上调KCC2可以减轻海马癫痫发作的严重程度。
图3 上调KCC2结合地西泮给药显著抑制癫痫大发作
(图源：Shi et al., Annals of Neurology, 2023)
由于上调KCC2本身能减轻癫痫发作严重程度，并且可能是通过GABAA受体起的作用，于是研究者们设想上调KCC2是否能提高一些以GABAA受体为药理学靶点的抗癫痫药物效率。研究者们采用了地西泮这种以促进GABA功能为药理学基础的抗癫痫药物，并利用快速电点燃大发作模型结合地西泮给药，发现只给予1mg/kg地西泮时并不能很好地抑制癫痫大发作，而只上调KCC2对于癫痫大发作也只有部分缓解作用，这也与图2结果相符。但当上调KCC2结合1mg/kg地西泮给药时能完全抑制癫痫大发作（表现为癫痫大发作时常GSD完全为0），这些结果提示KCC2可以提高耐药性癫痫中地西泮的抗癫痫效率。
图4 上调KCC2结合地西泮给药显著增加癫痫持续状态终止率
(图源：Shi et al., Annals of Neurology, 2023)
为了进一步验证上调KCC2是否确实能提高地西泮抗癫痫发作的药物效率，研究者们采用了海马海人藻酸诱导的耐药性癫痫持续状态模型，结果显示上调KCC2在海人藻酸诱导的癫痫持续状态模型中对地西泮疗效的改善作用与在海马电点燃模型中的结果一致，上调KCC2结合地西泮给药能显著增加癫痫持续状态终止率，将癫痫持续状态终止率由对照组的0%显著提高至75% (图 4c)，并减少了癫痫持续状态的终止时常(图 4b)，脑电发作能量也大大降低(图 4d)。这些结果提示我们上调KCC2在难治性癫痫持续状态模型中可以显著提高地西泮的癫痫终止效率。
图5 上调KCC2结合丙戊酸钠给药显著提高慢性癫痫自发模型中药物抗癫痫效率
(图源：Shi et al., Annals of Neurology, 2023)
为了进一步确认KCC2在难治性癫痫中的作用，研究者们采用了与临床癫痫发作更相似的模型——海人藻酸诱导的慢性癫痫自发模型，并且也将地西泮换成了临床更常用的一线药物丙戊酸钠。研究发现当只给予300mg/kg丙戊酸钠时并不能减轻癫痫发作严重程度 (图 5b、d、f)，而当上调KCC2后再给予300mg/kg丙戊酸钠能显著减少癫痫发作 (图 5c、e、g)，这些结果提示上调KCC2在慢性癫痫自发模型中可以显著逆转丙戊酸钠耐药性，为临床治疗难治性癫痫提供了新思路。
图6 上调KCC2能部分恢复癫痫反复发作导致的受损的GABA功能
(图源：Shi et al., Annals of Neurology, 2023)
为了进一步探究上调KCC2是否通过恢复受损的GABA功能来起到抗癫痫疗效，研究者们采用了钙信号这一技术手段，利用转基因小鼠Vgat-Cre 结合DIO-ChrimsonR和CaMKllα-Gcamp6(s) 混合病毒，在体激活GABA能神经并记录CaMKllα神经钙信号变化。研究发现基础状态下激活GABA能神经CaMKllα神经钙信号会显著下降，说明基础正常状态下GABA能神经可以显著抑制CaMKllα神经，然而在癫痫反复发作时，激活GABA 能神经CaMKllα神经钙信号并不会下降，说明癫痫反复发作会导致GABA能抑制功能受损，当上调KCC2 后再去激活GABA 能神经CaMKllα神经钙信号又呈现小幅度下降，提示我们上调KCC2可以部分恢复受损的GABA 功能。
该研究的第一作者为浙江大学药学院的博士研究生施佳颖、博士后辛虎虎，陈忠教授、平渊教授和汪仪教授为本文的通讯作者。研究受到了国家自然科学基金重点项目、国家自然科学基金优青项目、浙江省自然科学基金重大项目等的资助。
陈忠教授团队长期致力于癫痫、脑卒中等慢性脑病的发病机制解析与药物新靶点研究，前期原创性成果在Nature、Neuron、Nature Neuroscience、Nature Communications、Nature Nanotechnology、Science Advances、Annals of Neurology，Journal of Experimental Medicine、Biological Psychiatry、Current Biology、Journal of Cell Biology、Cell Reports，Autophagy等知名期刊发表论文300余篇，连续入选Elsevier高被引学者，并受邀在国际著名神经科学以及药理学杂志Progress in Neurobiology、Pharmacology & Therapeutics、Chemical Society Reviews、British Journal of Pharmacology等撰写综述。
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8 Gagnon, M. et al. Reply to The small molecule CLP257 does not modify activity of the K(+)-Cl(-) co-transporter KCC2 but does potentiate GABA(A) receptor activity. Nat Med 23, 1396-1398, doi:10.1038/nm.4449 (2017).
编辑︱王思珍
本文完