痰液分析对慢性阻塞性肺疾病诊疗及病情评估的研究进展
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痰液分析对慢性阻塞性肺疾病诊疗及病情评估的研究进展
慢性阻塞性肺疾病（COPD）发生在不同年龄段人群中，且以40岁人群好发，属于复杂异质性疾病，具有多种表型。COPD是由暴露在有毒颗粒气体后引起的气道和（或）肺泡异常导致的异质性疾病，并受肺发育异常等宿主因素的影响[1]。目前，COPD发病机制尚未阐明，且多数患者发病早期临床症状缺乏典型性，致残率与病死率较高[2]。我国40 岁以上人群中COPD的患病率高达13.7%，总患病人数约 1 亿[3]。多项研究提示在全球范围内，COPD急性发作可导致死亡率更高[4-5]。其特点为持续的呼吸症状与气流受限，且随着病程的延长，残疾率与病死率将会增加，临床上仅通过症状、肺功能检查，难以准确评估气道炎症的严重程度。虽然支气管肺泡灌洗液、支气管黏膜活检等能准确反映患者气道炎症，但对患者配合度要求较高，且患者耐受性、依从性较低，导致临床使用受限。痰液主要源于中央大气道，通过分析痰液生物标志物，进一步确定与临床指标、各种评分量表的关系，能辅助临床诊断、病情评估[6]。因此，本文探讨痰液分析在COPD诊治及病情评估中的应用效果，探索诱导COPD反复发作的炎症通路，细菌及病毒易感性增加的生物标志物及靶点，为COPD患者更精准治疗提供帮助。本文以COPD为起点，分析痰液分析在COPD中诊治及病情评估的效果、价值，综述如下。
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痰液分析评估COPD患者气道炎症及表型
一、COPD患者痰液分析与气道炎症及表型
COPD的发生与发展是一个多因素过程，临床上以不完全可逆气流受限为主要特征，属于慢性气道炎症，且患者发病后病程反复迁延，导致临床治疗难度较大[7]。痰微生物组与COPD中的临床和炎症表型相关[8]。半数COPD患者在稳定期气道内有潜在致病微生物定植。处于稳定状态的微生物群与COPD患者的表型之间可能存在复杂关系[9]。一项稳定期COPD患者的横断面研究，探索痰细胞类型与临床症状的关系，结果表明，呼吸困难组患者痰液嗜酸性粒细胞比例更高，而咳嗽组患者痰液中性粒细胞比例较高[10]。由此看出，痰液炎性细胞类型与COPD不同临床表型有关。同时有研究指出，中性粒细胞表型说明气道阻塞与肺气肿更严重，嗜酸性粒细胞表型与疾病恶化严重程度有关，而痰液嗜酸性粒细胞阳离子蛋白表达与COPD评估测试（COPD assessment test，CAT）症状及严重程度有关[11]。
对于未使用糖皮质激素（激素）治疗的轻、中度COPD稳定期患者，常规方法以血液生物指标测定为主，痰液与血液中嗜酸性粒细胞计数无相关性，但是外周血液嗜酸性粒细胞难以反映痰液中嗜酸性粒细胞，导致临床诊断及气道炎症评估存在局限性[12]。痰液嗜酸性粒细胞增多是否能说明气流受限具有可逆性需进一步研究与探讨[13]。一项研究以2 737例COPD患者为对象，入院后均收集痰液与血液标本。结果表明，痰液嗜酸性粒细胞含量高于血液，更能反映患者病情严重程度，能准确评估患者气道炎症反应，指导临床治疗，而血液嗜酸性粒细胞计数呈弱相关，假阳性率较高[14]。痰液分析用于COPD患者中，其气道评价价值高于血液指标，但COPD发病与气道炎症的关系需进一步研究与探讨[15]。
越来越多的证据表明，COPD患者与健康人中呼吸道微生物群不同，在疾病恶化加重期间发生变化，并与气道炎症相关[16-17]。一项关于调查COPD痰菌群及其与炎症表型和死亡率关系的研究提示，COPD患者痰菌群与临床及炎症表型相关。与变形菌纲(主要是嗜血杆菌)相关的微生物群落多样性减少，与中性粒细胞相关的蛋白谱和死亡风险增加有关[18]。通过纵向变异和细菌微生物群的生物分型，提示微生物群在COPD中不同的致病作用[19]。同时有一项研究关于在稳定期和加重期COPD痰微生物组与嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞COPD的关系，研究结果提示嗜中性粒细胞性COPD和嗜酸性粒细胞性COPD在某些患者中可互换，证实监测气道微生物组的时间变异性可跟踪患者炎症状态的时间[20]。
COPD好发于中老年人群，患者年龄较大，身体免疫水平较低，导致患者发病后病情变化较快。而COPD患者痰液中多以中性粒细胞为主，20.0%~40.0%嗜酸性粒细胞增高明显。Francis等[21]以83例COPD急性加重期患者为对象，并根据痰液中炎性细胞计数将其分为中性粒细胞型、嗜酸性粒细胞型、混合粒细胞型及粒细胞缺乏型4个不同亚型，对入组患者均完成14个月随访。结果表明，痰液炎性细胞在COPD不同时期均具有较高的稳定性，能准确反映患者疾病严重程度，可指导临床诊疗。
二、痰液宏基因测序在COPD患者的应用进展
高通量测序技术又称二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术或宏基因组测序（metagenomic NGS，mNGS），是近年来不断发展成熟的基因分析技术，具有检测快速（1~3 d）、灵敏度高、覆盖范围广的优点。相较于培养法及微量免疫荧光，NGS可有效提高病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他病原体诊断的敏感性和特异性，较少受抗菌药物使用的影响。目前16 S核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）基因测序仍然是呼吸道微生物组研究中最常用的技术，但宏基因组学和代谢组学越来越多地应用于其他科室的微生物组研究。近年来，NGS技术引入COPD研究[22⇓-24]，证实了宿主呼吸道中存在大量微生物。正因如此，与基于培养的呼吸道样本[25]分析相比，NGS已被证明是一种研究COPD的强大方法。这些方法基于对细菌16 S rRNA的研究，可以对构成微生物组的大多数细菌进行分类鉴定[26]，而此前的研究表明，COPD患者与健康受试者之间以及肺功能不同程度的COPD患者之间呼吸道微生物组的组成不同[27]。
多个研究提示呼吸道微生物组组成与COPD加重存在很强的联系[28⇓⇓-31]。COPD患者急性加重期和稳定期的队列中痰样本的微生物组组成有明显不同，显示COPD患者急性加重期间肺部微生物水平的复杂性。在急性加重事件期间微生物组研究中使用NGS可用于对患者进行分层[32]，明确COPD急性加重的病原体，更好地对患者进行分类，从而能寻找更多的生物标志物[33]，将更好地管理患者，并大大节省医疗保健支出[34]。这提示，NGS在COPD患者痰液分析中有重要地位，可早期干预患者急性加重，延缓患者肺功能下降，减少呼吸衰竭的发生。
痰液分析在COPD患者诊断、鉴别及病情严重程度中的评估
一、痰液分析在COPD患者诊断、鉴别中的应用
COPD辅助诊断及鉴别方法相对较多，常规诊断、鉴别方法以支气管扩张剂吸入后第1秒用力呼气容积与用力肺活量百分比（forced expiratory volume in one second/forced vital capacity，FEV1/FVC）<70.0%为主[35]。但是，由于COPD好发于中老年人群中，随着年龄增长，健康人群肺功能亦呈下降趋势，借助FEV1/FVC<70.0%以准确评估年轻者疾病严重程度；对于中老年人群则会出现过度诊断[36]。因此，临床上积极探索新的诊断指标，实现疾病的诊断与鉴别，对改善患者预后具有重要意义。
Venegas等[37]以COPD患者为观察组，选择同期健康体检者为对照组，2组均完成痰液分析及标本中中性粒细胞含量测定。结果表明，COPD患者痰液标本中中性粒细胞含量较高，能较为准确地反映疾病严重程度，可作为患者较为稳定的诊断标志物。COPD与哮喘发病机制具有一定的相似性，均以气流受限为特征，导致2种疾病诊断鉴别难度较大。
一项研究对中重度哮喘患者（72例）及COPD患者（70例）进行调查分析，并完成患者痰液标本的采集及分析。结果表明，通过痰液分析能对支气管哮喘和COPD患者进行诊断与鉴别[38]。通过痰液标本进行细胞因子分析及聚类分析，从而确定生物亚群[39]。哮喘与COPD患者生物亚群可分为三类，主要表现如下[40]：①以哮喘为主的嗜酸性粒细胞炎症；②以哮喘、COPD 2种疾病为主，两者能相互作用及影响，具有细菌定植作用，并引起重型粒细胞炎症和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平进一步升高；③在COPD患者痰液分析过程中多以混合细胞炎症为主，并伴有IL-6水平明显升高。由此看出，通过痰液分析能准确评估和鉴别COPD，可指导临床诊疗，为患者进一步个性化治疗奠定基础[41]。
二、痰液分析在COPD病情严重程度中的评估效果
当前，临床上对于COPD患者病情严重程度评估主要以临床表现、肺功能及相关量表为主，尽管上述指标能准确反映患者疾病严重程度，但常受患者文化水平、筛查配合度及对检查耐受性的影响，导致病情严重程度评估存在局限性[42]。有研究也提示，气道分泌物中细菌负荷的增加与COPD患者肺功能下降[43]和急性加重率增加[44]有关。而COPD患者急性加重多以痰液变化为最先发觉的症状，多数研究也显示急性加重最重要的环节包括感染[45]，细菌性病原体通常存在于COPD稳定期和急性加重期患者的呼吸道，但在COPD急性加重期时气道中细菌的多样性发生显著变化[46-47]。
Pragman等[48]报道，在稳定期COPD患者气道炎症表型也会频繁恶化，与α-多样性减少、聚类和分类丰度变化有关。Wisor等[49]以稳定期COPD患者为对象，进一步分析痰液与临床症状的关系。结果表明，痰液分析能反映患者疾病严重程度，且呼吸困难患者痰液嗜酸性粒细胞比例更高，伴有咳嗽患者痰液中性粒细胞含量较高；呼吸困难的COPD患者中，嗜酸性粒细胞比例较高，且临床诊断符合率为83.1%。由此看出，痰液分析与COPD患者病情严重程度、临床表现存在紧密联系，对于中性粒细胞表型的COPD患者常具有更加严重的气道阻塞与肺气肿，能反映疾病的恶化程度。另一项研究[50]对稳定状态下COPD患者痰液中分离的细菌是否与临床特征有关进行研究，对患者气道的微生物进行分析。该研究首次强调，肠道菌群的改变与稳定期COPD患者的不良临床症状有关，同时采用扩展培养法和质谱法对患者气道微生物进行分析，通过主坐标分析的细菌群落聚类分析表明，痰液微生物群的多样性和较高的细菌负荷与高发病率有关，这些新发现可能导致在临床微生物实验室日常实践中改变COPD痰液的处理。痰液微生物组多样性降低与中性粒细胞相关的蛋白质谱相关，且增加死亡风险[8]。也充分说明痰液检测在COPD中的重要地位。
COPD患者发病后下呼吸道与肺部慢性炎症过程常与细胞炎性因子表达水平有关。Onuska[51]研究显示，COPD患者肺组织中细胞因子如IL-1、IL-4、IL-12等有关，其表达水平能反映患者的疾病严重程度。一项研究用痰培养或聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测潜在致病菌（potentially pathogenic bacteria，PPB）与临床反应之间的关系，结果提示痰中流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的培养生长和PCR阳性均不能预测临床对抗菌药物的反应。因此，对于门诊COPD急性加重患者，这些检查是不必要的，然而痰涂片革兰染色和痰培养对预测痰中PPB的生长有重要意义[52]。
因此，加强COPD患者痰液分析，在稳定期及急性加重期都能反映患者的疾病严重程度，能评估患者疾病严重程度，为临床个性化治疗提供思路。
痰液分析在COPD患者药物治疗中的指导价值
从上述分析结果看出，与血液指标相比，痰液分析具有明显的优势，能准确反映患者疾病严重程度，亦可指导临床治疗。目前，临床上COPD治疗主要以药物为主，但选择何种精准治疗药物缺乏统一标准。在突尼斯的一项研究中，以各种方式评估细菌在COPD急性加重中的作用。结果显示COPD急性加重住院患者痰细胞学检查中痰定量细菌学检测阳性率低，耐药菌株比例大，且多耐药假单胞菌占主导地位，这有助于COPD急性加重患者的管理[53]。Szylińska等[54]研究表明：通过痰细胞学分类确定气道炎症类型，以便采取针对性治疗措施。嗜酸性粒细胞为主型可能对皮质类固醇或T辅助细胞2（T help cell 2，Th2细胞）因子治疗反应明显；对于中性粒细胞为主型患者，临床多采用抗菌药物或靶向中性粒细胞募集途径治疗；对于混合粒细胞为主型中Toll样受体与IL-6家族细胞因子潜在的治疗靶点，粒细胞缺乏型患者可能不需要抗感染治疗。Arafa[55]研究表明，基于痰细胞学分类的方法用于COPD患者治疗监测，能预防病情加重，治疗预后更好，治疗费用亦相对较低。一项研究提示气道微生物组可将中性粒细胞COPD分成不同的亚组，从而证明不同亚组患者的治疗方法可能有所不同[56]。由于COPD患者病情变化较快，治疗过程中气道炎症会发生明显变化，治疗期间应动态加强患者痰细胞学分类评估，指导临床治疗。
激素是COPD患者治疗常用的抗炎药物，但是药物类型较多，选择何种治疗方案缺乏统一的标准[57]。因此，了解COPD患者激素抵抗相关细胞与分子机制，寻找特异标志物，对改善患者预后具有重要的意义。Singh等[58]研究表明，COPD患者采用吸入型激素（inhaled corticosteroids，ICS）联合小剂量茶碱，能快速改善患者症状，逆转激素抵抗。有研究结果提示以氟替卡松为基础的ICS/长效β2受体激动剂（long-acting beta 2 agonists，LABA）治疗改变了COPD患者气道微生物组，导致α-多样性的相对减少和细菌类群改变更多[59]。这些数据可能对ICS引起肺炎的患者有意义，提示利用痰液分析可以评估患者长期吸入药物是否存在部分不良反应。一项研究[60]用COPD患者的痰样本进行纵向微生物组调查，结果强调了COPD炎症和加重相关的气道宿主-微生物组的显著相互作用，嗜血杆菌和莫拉菌影响COPD宿主免疫应答的不同组成部分，新的治疗策略应该考虑针对这些细菌及其相关的COPD宿主途径。这些研究表明，患者治疗过程中加强痰液分析，能反映患者疾病严重程度，可指导临床治疗，利用痰液检测可更为精准地进行针对性及科学性用药，促进患者恢复。
Meteran等[61]研究表明，抗炎药能影响上皮细胞趋化因子基序[chemokine（C-X-C motif）配体1（C-X-C motif ligand 1， CXCL1）]的产生，抑制CXCL8的产生，主要是由于CXCL1介导中性粒细胞炎症对激素与其他抗炎药物作用不敏感。预防COPD加重的靶向微生物治疗应仔细考虑稳定期的微生物组以及加重的微生物组[9]。纵向研究提示COPD患者微生物群的作用，同时提供药物开发的不同靶点，并探索新的微生物组分析方法，以指导未来的患者管理应用[19]。因此，COPD患者治疗过程中，通过加强痰液分析，能针对激素抵抗或联系调节机制提出新的治疗靶点，对控制病情发展具有重要意义，且多数患者能从中受益。
综上所述，COPD具有发病率、死亡率及复发率高等特点，常规以临床症状、肺功能及血液生化指标评估患者疾病严重程度，但上述评估方法存在诸多局限性，难以准确反映患者疾病严重程度。痰液易于获取，能反映气道细胞与生化物质成分。通过痰液炎性细胞、炎性因子的检测，采用聚类分析等方法提出更加具体亚群分类，能较好鉴别COPD与哮喘，亦可能准确反映患者疾病严重程度，使治疗更具科学性，促进患者恢复。因此，临床上对于COPD患者应完善有关检查，加强患者痰液分析，必要时可联合其他方法与指标，发挥不同方法优势，提高治疗效果。近年来，进行了多项关于COPD炎症生物制剂研究，但目前暂未用于临床，患者的局部气道炎症与全身炎症相关性尚不清楚。用药安全性及疗程均未得到证实，是否可通过气道局部用药获得疗效并减少全身不良反应也未可知，因此，期待未来能够对COPD气道分泌物进行更深入的研究，更精准地指导临床决策。