免疫治疗逐渐成为应对恶性肿瘤的一大重要手段，其通过激活机体免疫系统，识别并杀死特定的肿瘤细胞，产生免疫记忆效应，具有更为持久的疗效，包括免疫检查点阻断、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）、T细胞受体工程化T细胞疗法（TCR-T）等在内的免疫疗法已取得巨大成功。近年来，肿瘤疫苗作为免疫疗法的新兴成员，引发了广泛关注。然而，目前传统肿瘤疫苗存在抗原/佐剂包载效率低、淋巴结回流能力较差、体内利用率低和功能单一化等缺点，疗效不佳。
随着纳米技术的快速发展，基于各类生物材料的纳米载体已经成为肿瘤治疗的强大平台，将纳米载体应用于肿瘤疫苗的开发有望为上述问题提供解决方案。一般来说，纳米材料可以通过静电相互作用、疏水相互作用以及共价结合等多种方式实现对抗原和佐剂的高效包载。同时，纳米载体易于多功能化，有助于实现不同治疗方式与免疫治疗的联合，克服单一肿瘤治疗模式存在的缺点。
光热治疗（PTT）通过加热消融肿瘤产生肿瘤抗原以及其他免疫信号来激活抗肿瘤免疫反应。纳米硫化铜（CuS）以其制备简单、成本低及表面等离子体共振吸收引起的光热性能等特性受到了较多的关注。树状大分子具有高度支化、结构稳定可控、表面高官能化、低细胞毒性、无免疫原性等优势，是优良的载体基材。其中，聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子因其表面富含大量氨基，可与带负电荷的抗原及免疫佐剂产生良好相互作用，在构建肿瘤疫苗上具有潜力。与此同时，在其表面修饰苯硼酸（PBA）可与不同类型的蛋白质具有高结合亲和力，形成稳定的复合物，实现良好的胞内传递效率。
在研究团队早期工作中，已经证明两性离子修饰的PAMAM树状大分子可用于模板合成CuS纳米颗粒，具有良好的光热转换效率，用于肿瘤的化疗/光热治疗（Small Methods 2021, 5, 2100204）和光热/基因治疗（ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 6069-6080）。基于此，他们假设，构建表面修饰PBA分子、内部包裹硫化铜纳米颗粒的第五代PAMAM树状大分子与STING激动剂cGAMP的复合物，不仅可以通过PTT触发肿瘤免疫原性死亡并释放肿瘤抗原，还可以通过捕获原位生成的肿瘤抗原，进而形成纳米疫苗，实现PTT/免疫联合治疗。
为验证上述假设，东华大学史向阳教授团队设计了一种基于具有光热诱导效应的功能树状大分子纳米疫苗，可分别作为原位疫苗和预制疫苗，以实现对原发和远端肿瘤的有效治疗和预防肿瘤的发生（图1）。研究团队首先在第五代PAMAM树状大分子表面部分修饰PBA分子，并用于模板合成CuS纳米颗粒，随后，通过静电吸附作用使cGAMP与其形成复合物，实现PTT/免疫联合治疗，增强全身抗肿瘤免疫反应以及免疫记忆效应。
图1. 原位G5-PBA@CuS/cGAMP/antigen和预制G5-PBA@CuS/antigen/cGAMP纳米疫苗的合成及应用示意图。研究团队首先通过Uv-vis、TEM和光热转换性能测试证明了G5-PBA@CuS的成功合成，并具有良好的光热转换能力（图2a-e）。通过与BSA进行蛋白吸附实验，根据吸附前后吸光度差值可以得到经PBA修饰的材料能够很好地吸附蛋白（图2f）。该研究以小鼠黑色素瘤（B16-F10）为模型进行了体外、体内研究，在细胞毒性实验中，未经激光照射的细胞均保持较高的细胞活力，说明G5-PBA@CuS具有良好的细胞相容性；激光照射后，随着Cu浓度的增加，细胞活力逐渐降低，表明G5-PBA@CuS对B16-F10细胞具有良好的光热消融效果（图2g）。细胞吞噬结果表明，G5-PBA@CuS能更好的被B16-F10细胞所吞噬（图2h）。通过BCA检测抗原吸附量表明G5-PBA@CuS具有优异的抗原捕获能力（图2i），从而为纳米疫苗的构建提供便利。
图2.（a）不同浓度的G5-PBA@CuS的UV-vis光谱图；G5-PBA@CuS（b）TEM图片和（c）粒径分布直方图；（d）水和不同浓度的G5-PBA@CuS水溶液的光热升温曲线和（e）单个升降温循环曲线图；（f）不同浓度的G5-PBA@CuS和G5-NHAc@CuS与BSA孵育离心前后吸光度变化；（g）不同处理后B16-F10细胞CCK-8活力测试；（h）不同处理后B16-F10细胞对材料摄取情况；（i）BCA检测不同浓度的材料处理癌细胞后的抗原吸附量。紧接着，研究团队深入研究了G5-PBA@CuS/cGAMP对体外癌细胞的作用机制。通过激光共聚焦显微镜，胞外ATP和HMGB-1研究结果表明，激光照射下，G5-PBA@CuS/cGAMP能够引起胞内大量的CRT外翻至细胞膜上，刺激ATP分泌及HMGB-1释放（图3a-c），从而说明其可在体外诱导癌细胞发生免疫原性死亡（ICD）。通过Transwell实验及ELISA实验证明，引起的ICD能够熟化树突细胞，促进MHC-II的表达和IFN-β的释放（图3d-h）。
图3. 各组材料与B16-F10细胞共孵育后，（a）CRT的表达，（b）ATP的分泌，（c）HMGB-1的释放情况分析图；（d-e）各组材料刺激DCs熟化的分析图；（f-g）不同处理后DCs上MHC-II表达的分析图；（h）不同处理后DCs释放IFN-β量。对于（a-h）：Ⅰ，PBS；Ⅱ，G5-PBA@CuS；Ⅲ，G5-PBA@CuS/cGAMP；Ⅳ，G5-PBA@CuS + Laser；V，G5-PBA@CuS/cGAMP + Laser ([Cu] = 0.8 mM， [cGAMP] = 1 μg/mL)。随后，团队构建B16-F10小鼠皮下瘤模型，研究了G5-PBA@CuS/cGAMP对原发瘤的体内抗肿瘤免疫效应。实验结果表明，所有治疗方式均具有生物安全性，且PTT/免疫联合治疗组的治疗效果优于单一治疗模式，表现出最强的肿瘤抑制效果（图4b-d）。通过对肿瘤部位的免疫组织学观察，联合治疗组抑制肿瘤细胞增殖的效果最好，CRT表达显著，进一步说明联合治疗增强了肿瘤细胞的免疫原性死亡效应（图4e）。随后进一步分析了体内的免疫细胞表达情况，流式分析结果表明，联合治疗组脾脏部位的CD4+、CD8+ T细胞表达上调，调节性T细胞（Tregs）显著下调（图4f-h），证明通过PTT/免疫联合治疗能有效抑制肿瘤生长，增强体内抗肿瘤免疫反应。
图4. （a）小鼠体内治疗过程示意图；（b-c）治疗14天内小鼠体重及肿瘤体积变化曲线；（d）不同治疗后的小鼠生存曲线图；（e）治疗第14天肿瘤切片的TUNEL、Ki-67和CRT染色结果。（f-h）CD4+、CD8+T细胞和Tregs的流式定量图。对于（b-h）：Ⅰ，PBS；Ⅱ，G5-PBA@CuS；Ⅲ，G5-PBA@CuS/cGAMP；Ⅳ，G5-PBA@CuS + Laser；V，G5-PBA@CuS/cGAMP + Laser。 基于上述结论，研究团队进一步探究了G5-PBA@CuS/cGAMP作为原位纳米疫苗在体内同时治疗原发瘤和远端瘤的效果。可以看出，不同治疗组小鼠体重无明显变化，和其他组远端瘤随时间迅速增长的情况不同，G5-PBA@CuS/cGAMP + Laser组获得了最好的远端瘤治疗效果（图5b-c）。通过远端瘤的免疫荧光染色和流式分析结果表明，该组CD4+和CD8+ T细胞的肿瘤浸润效果最佳，且脾脏部位的CD4+、CD8+ T细胞表达上调，Tregs显著下调（图5d-g）。综上所述，在联合PTT/免疫治疗后，G5-PBA@CuS/cGAMP复合物具有在体内捕获原发肿瘤抗原的潜力，可形成原位纳米疫苗，从而触发全身抗肿瘤免疫，抑制远端瘤的生长。
图5. （a）小鼠体内治疗过程示意图；（b-c）治疗14天内小鼠体重及远端瘤体积变化曲线；（d）治疗第14天远端瘤切片的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞染色结果；（e-g）CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs的流式定量图。 随后，研究团队探究体外预制的G5-PBA@CuS/antigen/cGAMP纳米疫苗的体内抗肿瘤及肿瘤预防效果。以PBS为对照组，纳米疫苗未引起小鼠体重的明显变化，说明其具有良好的生物相容性，且小鼠肿瘤生长受到显著抑制（图6b-d），表明预制纳米疫苗能够有效触发小鼠体内抗肿瘤免疫反应。流式细胞术分析得到脾脏组织中CD4+和CD8+ T细胞的比例显著增加，表明纳米疫苗具有诱导CD4+和CD8+ T细胞介导的适应性免疫应答的能力（图6e-i）。
图6. （a）荷瘤小鼠体内治疗过程示意图；（b-c）治疗期间小鼠体重及肿瘤体积变化曲线；（d）不同治疗后的小鼠照片；（e-f）肿瘤部位CD4+、CD8+ T和Tregs细胞的流式分析；（g-i）CD4+、CD8+T细胞和Tregs的流式定量图。接下来，研究团队通过不同方式注射预制纳米疫苗探究其诱导的预防肿瘤效果。与PBS组相比，不同注射方式对小鼠体重变化无显著影响，腹腔注射后抑制肿瘤复发生长的效果最为显著（图7b-d）。这些结果表明，在体内注射纳米疫苗可有效抑制肿瘤复发生长，且腹腔注射的效果明显优于肌肉注射，这可能是因为腹腔注射纳米疫苗能更快速有效地刺激小鼠的全身抗肿瘤免疫反应。流式细胞术结果分析可得，与PBS组相比，接种疫苗小鼠脾脏中的效应CD4+ T细胞和CD8+ T细胞分布增加，Treg分布减少，腹腔注射组诱导的脾脏浸润的CD4+/CD8+ T细胞明显多于肌肉注射组。
图7. （a）小鼠体内治疗过程示意图；（b-c）治疗期间小鼠体重及肿瘤体积变化曲线；（d）不同治疗后的小鼠照片；（e-f）脾脏部位CD4+、CD8+ T细胞和Tregs的流式分析；（g-i）CD4+、CD8+T细胞和Tregs的流式定量图。简言之，该研究设计的G5-PBA@CuS/cGAMP纳米颗粒具有以下优势：1）所构建的纳米颗粒具有优异的光热转换效率和蛋白质吸附特性，并可与STING激活剂cGAMP复合后用于肿瘤的光热/免疫治疗，从而诱导免疫原性死亡，激活免疫系统；2）在激光照射后，G5-PBA@CuS/cGAMP复合物可有效联合PTT/免疫治疗抑制原发肿瘤，同时通过修饰的PBA分子捕获原发肿瘤抗原，形成原位疫苗，产生适应性免疫反应，从而有效抑制远端肿瘤的生长；3）在体外制备得到的G5-PBA@CuS/antigen/cGAMP复合物可作为预制纳米疫苗，对原发肿瘤进行免疫治疗，并通过所产生的免疫记忆效应来预防肿瘤的发生。本研究制备的G5-PBA@CuS/cGAMP纳米颗粒为构建纳米疫苗提供了新的思路。以上研究成果以“Photothermal-triggered dendrimer nanovaccines boost systemic antitumor immunity”为题，在线发表于国际著名期刊Journal of Controlled Release (DOI: 10.1016/j.jconrel.2023.01.076)。东华大学生物与医学工程学院史向阳教授为通讯作者，硕士研究生沈思妍为第一作者。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委、上海市科委及上海市领军人才计划等项目的资助。
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https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.01.076
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