泛瘤种丨精准医疗，NTRK融合靶向治疗新突破
从目前的临床实践应用来看，肺癌中的主要基因变异包括：EGFR（18、19、20、21、遗珠、胞外域、复合突变）、ALK、ROS1、RET、MET、HER2、KRAS、BRAF、NTRK、NRG1（点击阅读）等。今天我们分享NTRK融合靶向治疗。
原肌球蛋白相关激酶(tropomyosim-relatedkinase，Trk)是一类神经生长因子受体，其家族由高度同源性原肌球蛋白相关激酶A（tropomyosim-related kinaseA，TrkA）、原肌球蛋白相关激酶B（TrkB）、原肌球蛋白相关激酶C（TrkC）组成，分别由NTRK1（神经营养因子受体酪氨酸激酶基因）、NTRK2、NTKR3编码。Trk激酶与细胞增殖、分化、代谢、凋亡等密切相关。
A. Trk激酶都有一个同源保守的结构区域，该结构区域从N末端到C末端，分别包括5个细胞外结构域、1个跨膜结构域和1个细胞内的激酶结构域。
B. 神经营养因子与TRK蛋白质结合后可诱导受体二聚体化、磷酸化并激活下游PI3K、RAS / MAPK / ERK和PLC-γ的信号级联通路。TRK信号通路的改变，包括基因融合、蛋白过度表达或单核苷酸改变，已经被发现是许多肿瘤的致病原因，目前的研究发现约3%的肺腺癌存在NTRK1的重排，且不与EGFR、KRAS基因突变和ROS1融合基因同时存在。在结直肠癌中的发病率也低于5%，但该通路在各种癌种致病中共享，目前临床试验药物可以覆盖NTRK的泛癌种治疗。
C. 神经营养因子与TrK结合
1. 与 TrkA 结合的神经生长因子以神经生长因子（nerve growthfactor, NGF）和神经营养因子 7 （neurotrophin-7）为 主， 另 外 还 包 括 神 经 营 养因 子 6（neurotrophin-6）；
2. 与 TrkB 结合的神经生长因子包括脑源性神经营养因子（brain-derivedneurotrophic factor, BDNF）和神 经 营 养 因 子 4/5（neurotrophin-4/5）；
3. TrkC 特异性地和神经营养因子 3 （neurotrophin-3）结合。
Trk激酶结构
DOI: 10.1016/j.pharmthera.2017.02.006
Trk 激酶被认为与神经元细胞的生长、分化、凋亡等相关。Trk激酶在黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）、甲状腺癌、恶性骨髓白血病（AML）、恶性胶质瘤、星形细胞瘤、结肠癌等中都存在过表达，且这种过表达与肿瘤细胞的迁移有密切的关系。
Trk激酶在恶性肿瘤中通过多种机制激活，主要是结构重排和表达的改变。Trk激酶的编码基因NTRK重排产生嵌合癌基因，导致Trk激酶组成型激活，不再受到神经生长因子配体的调节和控制，具有致癌的风险。
DOI: 10.1038/s41571-018-0113-0
在结肠癌KM12细胞中，位于1号染色体长臂上的原肌球蛋白-3基因TPM3与NTRK1就发生了基因片段重排，TPM3在第7号和8号外显子之间断裂，NTRK1在第8号外显子内部断裂，然后，TPM3直接和表达胞内结构区域的NTRK1连接，异常表达TPM3-TRKA嵌合蛋白。这种基因的改变破坏了细胞中配体NGF与TrkA的相互作用，胞内TRKA处于过度表达和持续激活状态，而下游的PI3K/AKT、RAS/MAPK和PLCγ三条信号通路也处于异常活跃状态。
在分泌性乳腺癌、先天性纤维肉瘤和急性骨髓白血病（AML）中，ETV6-NTRK3型的基因融合高频发生。
2018 年2 月，N Engl J Med杂志在线发表了关于传奇神药Larotrectinib（LOXO⁃101）同时进行的三项安全性和有效性的研究结果，对于年龄为4个月至76岁的患者，针对17种不同肿瘤的总体应答率为75%，再次掀起了其靶点NTRK融合基因研究的热潮，我们回顾一下55 例NTRK 融合基因融合伙伴的情况，在25例NTRK1中，融合伙伴LMNA占28.00%（7/25），TPM3 占36.00%（9/25），IRF2BP2占8.00%（2/25），CTRC 占8.00%（2/25），其余融合伙伴TPR、PDE4DIP、SQSTM1、TRIM63、PPL 各占4.00%（1/25）；1例为NTRK2，其融合伙伴为STRN；29例为NTRK3，融合伙伴ETV6占96.55%（28/29），TPM4占3.45%（1/29）。
2017年5月，Nat Med杂志发表了一篇重量级文章，纪念MSKCC癌症研究中心的科学家采用MSK⁃IMPACT方法，开展了一项大规模、前瞻性的临床测序研究，他们对1万多名晚期癌症患者，接近300多种肿瘤进行基因二代测序检测，同时收集这些患者的临床注释、病理等方面的信息，其中NTRK1融合10例，非小细胞肺癌占0.13%（2/1563），且均为肺腺癌，融合伙伴P2RY8和VANGL2各1例；结直肠癌占0.31%（3/978），融合伙伴均为LMNA；胆囊癌占0.41%（1/242），融合伙伴为LMNA；黑色素瘤占0.57%（2/350），融合伙伴DDR2和GON4L各1例；软组织肿瘤占0.23%（1/438），融合伙伴为LMNA，原发灶未明肿瘤1例，融合伙伴为IRF2BP2。NTRK3融合13例，结直肠癌占0.10%（1/978），融合伙伴为ETV6；涎腺胰腺癌占0.41%（2/490），融合伙伴均为ETV6；甲状腺癌占1.77%（4/226），融合伙伴均为ETV6；涎腺肿瘤占4.81%（5/104），融合伙伴均为ETV6；胶质瘤占0.19%（1/512），融合伙伴为ZNF710。
2017年6月美国临床肿瘤学会（ASCO）年会上，Anna等报道，通过二代测序技术发现8例非小细胞肺癌发生NTRK融合现象，这些患者的中位年龄为53.5岁，一半以上均为男性，组织学类型大部分为腺癌87.50%（7/8）。NTRK1融合6例，融合伙伴IRF2BP2占33.33%（2/6），MPRIP、SQSTM1、TPR和VANGL2各占16.67%（1/6）；NTRK3融合2例，融合伙伴均为ETV6。
Hechtman等在23例NTRK融合肿瘤中发现，阑尾腺癌1 例（LMNA⁃NTRK1），结直肠癌5例［LMNA⁃NTRK1（2例），TPM3⁃NTRK1（2例）和ETV6⁃NTRK3（1例）］，胆囊腺癌1例（LMNA⁃NTRK1），胶质母细胞瘤4 例［AFAP1⁃NTRK1（1例），BCR⁃NTRK2（1例），EML4⁃NTRK3（1例）和ZNF710⁃NTRK3（1例）］，肺腺癌3 例［IRF2BP2⁃NTRK1（1例），P2RY8⁃NTRK1（1例）和TPM3⁃NTRK1（1例）］，乳腺癌1 例（ETV6⁃NTRK3），涎腺癌4 例（均为ETV6⁃NTRK3），黑色素瘤2 例［TRIM63⁃NTRK1（1例）和TRAF2⁃NTRK2（1例）］和肉瘤2 例［LMNA⁃NTRK1（1例）和TPM4⁃NTRK3（1例）］。
2015年10月Farago等在 J Thorac Oncol上发表的一项研究中，他们也是利用AMP方法对1378例非小细胞肺癌患者的标本进行检测，发现有1 例患者出现SQSTM1⁃NTRK1 融合基因。
2017年11月欧洲临床肿瘤学会亚洲（ESMOAsia）会议上报道了亚洲日本人群非小细胞肺癌NTRK融合情况，在2668例患者中仅发现1例ETV6⁃NTRK3（0.04%）。
Pietrantonio等报道了结直肠癌中13例NTRK融合，其中LMNA⁃NTRK1为3 例，TPM3⁃NTRK1为7例，SCYL3-NTRK1为1例，ETV6-NTRK3为2例。
NTRK基因融合的检测方法也包括荧光原位杂交（FISH）、免疫组化（IHC）、荧光定量PCR （RT-PCR）和高通量测序（NGS）等方法。
NGS用于NTRK基因融合检测可分为DNA-seq与RNA-seq两种方案，即分别针对DNA与RNA样本进行检测。考虑到融合基因的断点一般都位于内含子区域，对于一些内含子序列较长的基因，比如NTRK2和NTRK3，通过DNA全面覆盖各类融合突变比较困难。如果用RNA的话，只要找出异常的外显子拼接就可以了，很容易就能解决这一问题。而且一部分患者即便在DNA水平检测到NTRK融合阳性，也不一定产生TRK融合蛋白，因此使用靶向药物依旧可能无效，而RNA测序得到的融合基因都是有可能表达出蛋白的，因此对临床的指导意义更为明确。大量的实验早已证明，RNA-seq更适合临床样本的融合基因检测。
2014年，美国癌症研究学会（AACR）提出了基于精准医学的两大创新性临床试验概念，即篮子试验和雨伞试验（Umbrella Trial），以实现精准的“异癌同治”与“同癌异治”的目的。雨伞试验，是对某一类肿瘤进行疾病驱动基因分型、再予以对应精准靶向施药的临床试验。篮子试验，是将带有特定相同分子事件（如基因突变、融合、扩增等）的不同瘤种放进同一篮子进行药物临床试验。以同一分子事件为依据，指导不同疾病治疗的理念将带来全新的开放式治疗思维。
目前靶向NTRK融合基因的临床在研新药共有11种，它们都具有Trk激酶抑制活性，大多通过与ATP竞争结合位点实现抑制激酶催化活性，其中Larotrectinib、Entrectinib较具竞争潜力。
2017年12月下旬， 拜耳公司和Loxo Oncology公司合作开发的口服选择性原肌球蛋白相关激酶（Tropomyosin-relatedkinase，Trk）抑制剂Larotrectinib在美国递交新药上市申请，用于治疗携带NTRK融合基因的成人或儿童实体瘤。之前Larotrectinib已被FDA授予孤儿药资格和突破性疗法认定。该事件是精准医学走向实践的重要一步，也是基于精准医学设计的创新性临床试验-篮子试验（Basket Trial）的又一伟大实践。
ASCO会议
2017年ASCO会议，公布的Larotrectinib的疗效数据：在I期和II期临床试验中，共招募了55例涉及13种不同肿瘤类型的NTRK融合患者，包括唾液腺癌（12人）、肉瘤（10人）、婴儿纤维肉瘤（7人）、肺癌（5人）、甲状腺癌（7人）、结直肠癌（4人）、黑色素瘤（4人）、胆管癌（2人）、胃肠道间质瘤（2人）、其他肿瘤（4人），其中46个可评估的患者整体反应率（ORR）达78%，有2位患者肿瘤完全消失，最长应答时间达23个月。Larotrectinib有望成为第一个通过“篮子试验”获批的小分子靶向药物。
罗氏/Ignyta合作开发的口服Trk、ROS1和ALK蛋白强效抑制剂，对携带NTRK1/2/3、ROS1或ALK融合基因的晚期或转移性肿瘤患者具有快速持久的疗效，且可以通过血脑屏障。
01
I期临床试验数据
I期临床试验数据显示：24个可评估患者的ORR为79%，且该药起效较快，均在治疗的第1个月内起效。其中对NTRK基因融合的患者缓解率为100%，对ROS1基因融合的患者缓解率为85%，对ALK基因融合的患者缓解率为57%；其中1位脑转移患者也被治愈。
02
多项临床研究整合分析
基于多项临床研究的整合分析数据，包括II期STARTRK-2、3项I期（STARTRK-1、ALKA-372-001、STARTRK-NG）。数据显示：54例NTRK融合阳性实体瘤患者的总反应率（ORR）为57.4％，中位反应持续时间（DOR）为10.4个月。此外，中位PFS（无进展生存期）为11.2个月，中位OS（总生存期）为20.9个月。NTRK融合阳性实体瘤共包括具有超过19种组织病理学的10种肿瘤类型。肿瘤类型包括乳腺癌、胆管癌、结肠直肠癌、妇科癌症、神经内分泌肿瘤、NSCLC、唾液腺癌、胰腺癌、肉瘤和甲状腺癌。综合分析的结果显示，在10种实体肿瘤类型中均得到应答，无论在基线时有和没有CNS转移的患者。颅内ORR（客观反应率）为54.5％，其中超过25%的患者达到完全缓解。在几个亚组分析中，客观反应率是一致的，包括基线时有脑转移（50.0％，n=12）与无脑转移（59.5％，n=42）；NTRK基因融合类型-NTRK1（59.1％，n=22），NTRK2（0％，n=1）和NTRK3（58.1％，n=31）。
II期STARTRK-2篮子试验
在国际、多中心、开放标签、正在进行的II期STARTRK-2篮试验（NCT02568267）中，研究人员正在招募300名患有实体肿瘤的患者，他们的肿瘤基因检测后需要NTRK1/2/3、ROS1或ALK基因融合阳性。主要终点是ORR；次要终点包括DOR，响应时间，临床受益率，颅内肿瘤反应，无进展生存期（PFS），中枢神经系统（CNS）PFS和总生存期（OS）。
I 期STARTRK-1试验
多中心，开放标签，剂量递增，I期STARTRK-1试验（NCT02097810）评估了美国和韩国的使用NTRK1/2/3、ROS1或ALK阳性实体瘤患者的每日连续给药方案。
研究人员通过标准剂量递增评估了Entrectinib的安全性和耐受性，并确定推荐的剂量的Entrectinib为每日400mg/m2。
I 期ALKA-372-001研究
多中心，开放标签，剂量递增，I期ALKA-372-001研究（NCT02097810）评估意大利患有TRK A/B/C、ROS1或ALK基因融合的晚期或转移性实体瘤患者的间歇性和连续性Entrectinib给药方案。
I/Ib期STARTRK-NG研究
该申请还基于I/Ib期STARTRK-NG研究的结果。I/Ib期剂量递增和剂量扩展STARTRK-NG研究正在研究entrectinib在没有治愈性一线治疗选择，复发性或难治性颅外实体瘤或原发性中枢神经系统肿瘤的儿科和青少年患者中，对比有或没有TRK、ROS1或ALK融合的安全性和有效性。
STARTRK-NG试验的结果在2018年ASCO年会上公布，证明3名儿童和年轻成人靶向基因融合患有晚期，先前治疗过的CNS肿瘤：DCTN1-ALK炎性肌纤维母细胞瘤（IMT），TFG-ROS1 IMT和EML4-NTRK3婴儿纤维肉瘤-对Entrectinib有反应。根据这些数据，研究人员确定推荐的儿童、青少年和实体瘤患者的治疗剂量为，每日剂量为550mg/m2。
常见不良反应：关于安全性，使用Entrectinib的不良事件（AEs）与先前研究中观察到的一致。最常报告的AE包括疲劳，便秘，味觉障碍，水肿，头晕，腹泻，恶心，感觉迟钝，呼吸困难，疼痛，贫血，认知障碍，体重增加，呕吐，咳嗽，血肌酐增加，关节痛，发热和肌痛。
拜耳公司和Loxo公司合作开发的第二代Trk激酶抑制剂，用于对抗Trk激酶的耐药突变，如TrkA出现G595R突变或TrkC出现G623R突变等。目前已有2名患者在出现LOXO-101耐药后成功接受LOXO-195治疗。
Exelixis公司开发的多靶点激酶抑制剂，该药物已被FDA批准用于转移性骨髓性甲状腺癌和晚期肾细胞癌的治疗，现正开展针对ROS1/NTRK基因融合的非小细胞肺癌的II期临床研究。
TP Therapeutics公司开发一种针对ALK、ROS1和Trk家族激酶的抑制剂，目前正在开展针对ALK/ROS1/NTRK1-3融合的晚期实体肿瘤的I/II期临床研究。
Daiichi Sankyo开发的Trk/ROS1激酶抑制剂，目前I期临床试验结果已公布。试验入组15例ROS1融合的晚期NSCLC患者，7例患者肿瘤部分缓解，5例疾病稳定，此外脑转移患者也出现临床缓解。该试验确认了II期的推荐剂量为每日600mg。
进入临床的药物还包括礼来公司的Merestinib，Amgen/Tesaro合作开发的Belizatinib，Ono Pharmaceutical的ONO-7579，Plexxikon的PLX7486和Mirati的Sitravatinib，目前尚无相关的临床试验结果被报道。
NTRK1获得性耐药突变：V573M，F589L，G595R，G667C，G667S，A608D等
NTRK2获得性耐药突变：Q596E，V601G，G623S，G693S，R630K等
NTRK3获得性耐药突变：G623R，G696A等
旁路途径的激活：BRAF突变，ALK融合，MYC扩增，CCNE1扩增等。
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