Cancer Commun丨基于DNA+RNA测序PANO-Seq®技术肺癌NTRK融合流行病学数据及恩莎替尼治疗疗效分析

导读：

FDA已经批准了Larotrectinib和Entrectinib两款NTRK-TKI用于治疗携带NTRK基因融合变异，且没有已知获得性耐药突变的成人和儿童泛实体瘤患者。这两款药物治疗NTRK 基因融合阳性的患者显示出较高的缓解率和持久的应答，并可显著改善患者生活质量。Larotrectinib和Entrectinib目前正在国内开展注册临床试验。国内众多药企也积极布局NTRK-TKI的开发，其中TL118（韬略生物）、ICP-723（诺诚健华）、Repotrectinib（再鼎医药）、SIM1803-1A（先声药业）、BPI-28592（贝达药业）、TQB3558（正大天晴）、VC004（威凯尔医药）、FCN-011（复创医药）已开始I期临床研究；Taletrectinib（葆元生物）已开始II期临床研究； LPM4870108（绿叶制药）、HG030（白云山制药/成都先导）已获得临床试验默示许可，即将进入临床研究阶段。NTRK融合虽广泛分布于实体瘤中，但总体发生率较低，准确有效地检测到NTRK融合事件是临床研究成功的关键因素。相信在不久的将来，这些药物上市后会给更多的NTRK融合阳性的实体瘤患者带来临床获益。

近期恒特基因与临床专家多中心合作基于DNA+RNA测序PANO-Seq®技术国际上首次报道中国人群肺癌NTRK融合流行病学数据及首次报道恩莎替尼治疗NTRK融合的疗效分析。

背景：

NTRK1/2/3基因（神经营养因子受体酪氨酸激酶基因）融合广泛分布于多种实体肿瘤中，但在发病率和死亡率最高的肺癌中，当前的研究显示，仅有0.1%-0.3%的肺癌患者携带原癌驱动基因NTRK1/2/3融合事件。肺癌中NTRK融合较为罕见的原因之一可能是缺乏有效检测，IHC检测NTRK融合的灵敏度较低，FISH无法精确地鉴别出融合伙伴和融合断点位置等重要信息[3]。NTRK系列融合的融合伙伴众多，融合断点广泛分布于内含子区域，从而导致基于DNA为模板的NGS在检测NTRK融合变异时仍存在一些局限和不足[3]。基于RNA为模板的NGS在检测NTRK等融合变异上相较DNA-NGS更为有效[4]。最具代表性的Anchored multiplex PCR（单端锚定多重PCR）这一单向滑动RNA测序的方法[5]，不仅能够检测已知的NTRK的融合类型，还可以检测出未知的NTRK融合类型，而无需预知融合伙伴和融合断点位置的信息。纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC）的一项大队列真实世界研究中[3]，先前基于DNA的NGS中没有检测到驱动变异的肺癌样本中，基于AMP技术的靶向RNA测序能够鉴定多种基因融合，包括在肺腺癌中非常罕见的NTRK的基因融合。(图1)

图1. MSK-IMPACT DNA Panel检测为驱动阴性的样本经基于AMP技术开发的RNA-Seq Panel检测到包括NTRK融合在内的多种融合重排和跳读驱动事件。

FDA已经批准了Larotrectinib和Entrectinib两款NTRK-TKI用于治疗携带有NTRK基因融合变异，且没有已知获得性耐药突变的成人和儿童泛实体瘤患者。这两款药物显示出了对NTRK 基因融合阳性的治疗患者具有较高的反应率和持久的应答，并可显著改善了患者生活质量。针对治疗后出现的NTRK依赖性的耐药突变，第二代的NTRK-TKI如Repotrectinib也进入了临床研究阶段。一些最初为抑制其他激酶靶点而开发的抑制剂（如:克唑替尼）也可能有效地靶向NTRK融合蛋白激酶。

研究介绍：

近期，中国科学院大学附属肿瘤医院，湖南省肿瘤医院，浙江省荣军医院等多家单位与恒特基因合作采用PANO-Seq®技术开发的DNA+RNA合并检测Panel检测到肺癌中的罕见NTRK融合，并指导临床治疗，取得了较好的治疗效果。相关内容发表在《Cancer Commun》（IF：5.62）上[1]。本研究使用PANO-Seq技术的Panel共检测了1125例肺癌患者，其中829 （74%）为肺腺癌患者。在检测合格的肺腺癌样本中，有48%的患者检出了EGFR驱动突变，有10%的患者检出了ALK, ROS1,RET, BRAF, NRG1融合驱动变异和MET 14号外显子跳读变异以及1例非常罕见的（HLA-DRB1）-MET 融合变异。（表1）

表1. PANO-Seq®技术开发的DNA+RNA合并检测的Panel从1125例肺癌组织样本中检测到的复发性突变和基因融合变异。

在这一研究中共检测到了5例NTRK1融合，其中3例回顾性样本分别为：TPR-NTRK1，SQSTM1-NTRK1和RFWD2-NTRK1。2例通过长三角肺癌协作组青年团队的e药安全平台招募并给予患者恩莎替尼治疗。阶段总结丨长三角肺癌协作组NTRK基因融合临床研究招募阶段总结

携带TPR-NTRK1融合的患者的病历显示初诊为肺腺癌IV期，左肺为原发病灶并双肺转移，基因检测结果显示EGFR和ALK为阴性，一线接受吉西他滨联合顺铂化疗，部分缓解(PR)达6.7个月，疾病进展后随即入组Checkmate-078 III期临床研究，接受纳武利尤单抗的二线治疗，初始治疗44天后疗效评估为疾病稳定（SD），初始治疗90天后疗效评估显示疾病进展（PD）（图2）。患者经细针穿刺活检，使用恒特基因的DNA+RNA合并检测Panel检测出TPR-NTRK1融合。

图2. 该患者经纳武利尤单抗二线治疗后发生了超进展( HPD)。

携带SQSTM1-NTRK1融合的患者病历显示初诊为右肺原位腺癌Ia期，患者接受手术切除后并未进行系统性治疗；携带RFWD2-NTRK1融合的患者病历显示初诊为肺右下叶鳞状细胞癌Ib期，患者接受手术切除后并未进行系统性治疗。

2例为正在接受临床治疗且出现耐药后的患者经液体活检检测到的TPR-NTRK1和SPATA46 -NTRK1融合。

TPR-NTRK1融合阳性患者的病历显示初诊为肺腺癌IV期，左肺为原发病灶并双肺转移，一线接受培美曲塞联合奈达铂化疗，疾病稳定（SD）2个月，行基因检测，结果显示为EGFR L858R阳性，随即接受代一代EGFR-TKI厄洛替尼治疗，部分缓解(PR)达16个月（图3B），疾病进展后接受三代EGFR-TKI奥希替尼治疗，部分缓解（PR）达17个月（图3B），疾病再次进展，行液体活检基因检测，未能检测到之前的耐药突变EGFR T790M（EGFR T790M丢失），但检测到了TPR-NTRK1融合，并得到了Sanger测序的确证（图3A）。推测TPR-NTRK1融合这一旁路激活为奥希替尼的耐药机制，随即给与奥希替尼+恩莎替尼（多激酶抑制剂） 联合治疗，左肺病灶达部分缓解（PR），胸腔积液也明显减少。联合治疗2个月后经评估为疾病稳定（SD）（图3C），联合治疗5个月后经评估显示疾病进展（PD）（图3C），患者拒绝进一步治疗，于2个月后去世。

图3. A. NGS检测到的TPR-NTRK1融合结果得到了Sanger测序法的确证；B. 患者在出现TPR-NTRK1融合前已接受过第1代和第3代EGFR-TKI的治疗；C.经奥希替尼+恩莎替尼联合治疗达疾病稳定。

SPATA46-NTRK1融合阳性患者的病历显示初诊为右肺肺腺癌IV期，左锁骨上方淋巴结肿大，基因检测结果显示为EGFR p.E746_A750del阳性。一线接受一代EGFR-TKI吉非替尼治疗，达部分缓解（PR），无进展生存期（PFS）达24个月，疾病进展后基因检测结果为EGFR T790M耐药突变阳性，随即接受三代EGFR-TKI奥希替尼治疗，治疗6个月后疾病再次进展，进一步接受帕博利珠单抗联合紫杉醇治疗，反应较差且淋巴结病灶出现了超进展（HPD），行液体活检基因检测，检测到之前的EGFR p.E746_A750del，但EGFR T790M突变丢失，新检测到了SPATA46-NTRK1融合，并得到了Sanger测序的确证（图4)，推测SPATA46-NTRK1融合这一旁路激活为奥希替尼的耐药机制，随即给与埃克替尼+恩莎替尼联合治疗，在右肺原发灶和淋巴结转移灶中观察到持久反应，肿瘤明显消退，达部分缓解（PR）（图5）。

图4. NGS检测到的SPATA46-NTRK1融合的IGV视图，并得到了Sanger测序法的确证。

图5. 经埃克替尼+恩莎替尼联合治疗后，右肺原发灶和淋巴结转移灶中观察到持久反应，肿瘤明显消退。

恩莎替尼对无耐药突变的 NTRK融合蛋白具有抑制活性：

为评估恩莎替尼对NTRK融合蛋白的抑制能力，本研究使用Ba/F3细胞系构建了携带野生型LMNA-NTRK1融合、溶剂前沿发生G595R突变的LMNA-NTRK1融合以及溶剂前沿发生G623R突变的ETV6-NTRK3融合这三株细胞系，G595R突变和G623R突变为第一代NTRK-TKI的耐药突变。恩莎替尼对野生型LMNA-NTRK1融合的Ba/F3细胞的半抑制浓度（IC50）为57 nmol/L（图6A），而Larotrectinib对野生型LMNA-NTRK1融合的Ba/F3细胞的半抑制浓度（IC50）仅为10 nmol/L。携带G595R和G623R等耐药突变的Ba/F3细胞均无法被恩莎替尼和Larotrectinib抑制（图6B, 6C），表明携带有耐药突变的细胞系就有很高的靶向特异性。

图6. A. 恩莎替尼对野生型LMNA-NTRK1融合的Ba/F3细胞具有抑制活性；B. C. 恩莎替尼对携带有溶剂前沿耐药突变的NTRK1融合的Ba/F3细胞基本无抑制活性。

小结：

使用DNA+RNA双模版在同一个“反应体系”内同时检测点突变、插入缺失和融合重排变异更加准确高效。本研究发现在中国肺癌人群中NTRK1融合的原发比例约为0.3%。本研究还表明在特定的情况下恩莎替尼可作为替代特异性的NTRK-TKI治疗携带NTRK 融合变异的疗法。准确的检测和及时的治疗可为NTRK阳性患者带来临床获益。

融合基因变异型肺癌二代测序技术介绍

2013年，郑宗立博士在哈佛医学院麻省总医院工作期间发明了肿瘤基因检测技术--AMP（锚定多重PCR法）技术，其兼具杂交捕获法检测全面精度高和超多重PCR操作简便灵敏度高的优势，迅速在美国的顶级医院麻省总医院（综合排名多年全美第一）得以推广，成为该医院主要的肿瘤分子检测手段。该发明于2016年11月获得美国专利局专利，当时率先采用的一些关键技术（如单分子标记除重、多区域标签等）直至今日仍只有少数厂家能成熟掌握。

2017年，郑宗立博士带领的海外归国团队创立恒特基因公司并开发了PANO-Seq全景测序是新一代的原创肿瘤测序技术平台，性能全面优于AMP。

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