独家丨基于久经临床考验的下一代测序技术平台，利用基因编辑和T细胞免疫全面防治肿瘤！

贝壳社-张楠 e药安全 2023-01-13

江浙沪地区历届重要肺癌论坛汇总（长三角地区肺癌论坛系列）

长三角地区肺癌MDT多学科讨论和科研学术沙龙系列汇总

写意人物丨陆舜教授：从PI的角度看中国创新药的发展

陆舜教授：沃利替尼有望成为首个代表中国走向全球的肺癌靶向创新药物

【喜讯】| 恭喜上海交通大学附属胸科医院陆舜教授团队荣获2020年度中国抗癌协会科技奖一等奖

走进中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）I期临床试验病房

这个故事可以从一个重磅新闻说起。2017年11月16日，美国FDA宣布全球著名的斯隆•凯特琳癌症研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，简称MSK）基于二代测序技术的癌症基因检测分析平台MSK-IMPACT™获得批准。这被视为2017年又一重大科学成果，影响深远，将开辟癌症基因检测的学术研究和商业化先河。

MSK-IMPACT^™由MSK开发，是一个全面检测癌症的平台，能一次性对病人肿瘤468个基因的基因突变及遗传变异进行快速灵活的检测。据了解，MSK-IMPACTTM检测平台之所以能获批，源于MSK近期完成的一个著名科学研究，结果发表已在2017年5月8日的《Nat Med》上。

《Nat Med》文章显示，MSK研究者利用MSK-IMPACT^™对超过1万名晚期癌症患者进行了基因测序。这是迄今为止癌症患者中规模最大的肿瘤测序研究，也是具有里程碑意义的重要研究，为全球癌症诊疗开创了新模式。

（MSK发表的文章）

虽然MSK-IMPACT^™技术归MSK所有，但在实际研究中，尤其是涉及RNA检测基因融合的部分，MSK却采用了一种更先进的“AMP（Anchored multiplex PCR，锚定多重PCR）”专利技术，而不是MSK独家研发的MSK-IMPACT^™。

（MSK发表文章中关于运用AMP检测技术部分）

该AMP技术是由恒特基因联合创始人、首席科学顾问郑宗立博士在哈佛医学院工作期间发明，2014年成果发表在《Nat Med》上。当年该发明问世后，美国哈佛医学院麻省总院的综合诊断中心随即采用，目前已作为主要检测技术得到广泛应用。

（郑宗立博士2014年发表AMP文章）

替代金标准FISH的AMP技术

实体肿瘤病理组织中携带突变的癌细胞占所有细胞比例可低至1~5%，而血液中游离突变DNA的含量占总游离DNA可低至0.1%，或更低。所以，同时满足多位点、高灵敏度检测需求的新技术成为精准医学检测的关键所在。

目前，对指定基因位点进行富集再测序的技术可分为杂交捕获和多重PCR两大类。杂交捕获技术作为传统方法，不少生物公司在探索创新，试图改进以往捕获效率低，样本使用量高，操作复杂等弊端；而多重PCR技术虽然操作简便、灵敏度高，但由于反应体系中不同引物可能相互干扰，使得结果均一性较差，造成部分位点的漏检，市场上很多公司难以克服上述瓶颈。郑宗立博士攻克了多重PCR的设计难关，开发出独特的多重PCR反应体系，采用全新的分子条码设计，实现了多位点的均一覆盖及超高灵敏度的液体活检要求。

郑宗立博士介绍，福尔马林固定的石蜡组织样本（FFPE）中，DNA和RNA常有断裂、损坏等问题，是肿瘤分子诊断的难点。而AMP技术是一种为NGS生成富集目标序列文库的快速、简单、易扩展的方法，适用各种类型、质量参差不齐的临床样本，特别是微量DNA和RNA样本，能在数小时内轻松建成测序文库。

数据显示，AMP技术于2013至2015年累计了一万例以上的临床应用验证，结果证明拥有100%的临床灵敏度和100%临床特异性（实测986份样本；检测成功率97%，成果发表于2014年Nat Med）。正因其具有高效稳定、高灵敏度、高特异性等优势，成为美国麻省总院主要的肿瘤分子病理检测方法。作为比较，据文献报道，Foundation Medicine的杂交捕获方法的检测成功率是85%（Nat Biotechnol，2013；注：还只是针对DNA检测的成功率，而不包含更不稳定的RNA）。

（来源：美国麻省总院网站）

“也因为结果理想，我的导师John Iafrate（曾为FDA编写FISH法检测基因融合的标准实验流程）在自己的实验室已将金标准FISH法全替换成了AMP法了。” 郑宗立博士曾在采访中表示。

AMP最突出的优势是能发现和检测新的融合基因。麻省总院研究人员曾应用 AMP技术，相继发现ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3 等新的基因融合，ROS1还被证实对克唑替尼敏感。这帮助医生准确诊断ROS1病例（其他方法常常检测为阴性），效果很显著，该成果也发表于2014 年 11 月的《N Engl J Med》上。

实际上，除基因融合外，AMP也同时对其他变异类型进行检测，包括点突变、插入和缺失、拷贝数、RNA表达等，几乎覆盖所有突变类型，可以使用 DNA 或 RNA 为模板，能对数个至数百个基因同时进行平行检测。

促进基因编辑、细胞治疗从研发迈向临床

在2017年11月23日中国精准医疗产业领袖峰会上，郑宗立博士围绕基因编辑和细胞治疗等前沿科学技术做了主题报告。

他介绍，CRISPR可以对基因组内的任何基因进行修改，能高效地对任何生命体进行基因组“手术”。然而CRISPR基因编辑技术虽功能强大，但隐藏着巨大的安全隐患，因为切割不准确会造成脱靶。在应用上，我们在乎被编辑过的每一个细胞，因为哪怕仅有一个细胞因脱靶导致癌基因被激活或者抑癌基因被敲除，都会对患者的安全埋下隐患。

基于AMP技术平台的全基因组无偏寻找CRISPR脱靶技术（GUIDE-Seq）能全面、灵敏地找出CRISPR编辑脱靶位点。AMP技术平台是经过了临床考验的一个平台，并且获得了全美审查最严格的纽约州的认证。因此，基于AMP技术平台而开发的CRISPR脱靶找寻方法可以为各种以CRISPR为基础的细胞治疗的安全把关，包括CAR-T或TCR-T等疗法，将威胁因素找出来，推动CRISPR技术真正走向临床。

一次性检测所有突变、两种核酸的测序技术

继AMP技术之后，郑博士带领恒特基因开发出新一代的PANO-Seq^{^®}全景测序技术。他创办的恒特基因由此成为全球少数拥有自创反应体系的公司之一。PANO-Seq^{^®}首创单管集成 DNA + RNA 同时检测，并在试剂和算法上取得突破，以满足液体活检对灵敏度和特异性的更高要求，在一个反应管体系内一次完成所有变异类型及两种核酸的“全景测序”目的。

据了解，PANO-Seq^{^®}技术的样本来源更灵活，可选取实体肿瘤的手术切块、穿刺样本、石蜡切片或血液肿瘤的全血，或上述组织来源的DNA和RNA等；检测涵盖多个抑癌基因全编码区及肿瘤驱动基因的突变多发区域。

贝壳社了解到，继郑宗立博士完成PANO-Seq^{^®}专利技术发明后，恒特基因正在进行全新产品的转化升级和商业开发。

首先是针对临床检测基因融合困难这一痛点，以提高融合检测质量为主，同时涵盖其它突变类型。恒特基因CEO告诉贝壳社，基因融合现象在癌症检测中非常重要，当前很多癌症检测不出变异基因，有一大部分就是因为发生了基因融合。“目前国内很多肿瘤医院专家在跟我们合作，因为很多样本用不同技术、不同公司检测结果都不稳定，所以想用恒特基因更全面的技术再检测一次。”

2017年ASCO大会上，有报告指出只要检测出NTRK基因融合，LOXO-101（TRK抑制剂）对不分组织来源的13种癌症都有疗效，有望成为第一个上市的“广谱靶向药物”。恒特基因CEO认为，现阶段已知的基因融合还是少数，但郑博士发明的技术能发现新的融合类型，也为后续靶向药物开发提供线索，所以融合基因检测在未来必然会成为趋势，今后人们会越发意识到其重要性。“所以我们的技术一直走在市场前面”，她说到。

恒特基因的另一个新方向是针对下一代肿瘤精准医疗测序，从T细胞而非传统的肿瘤细胞视角为突破口进行测序，破解肿瘤难题。

针对肿瘤，郑宗立博士更偏向观察T细胞层面，因为T细胞能反映整个机体对肿瘤的免疫状态。他解释，传统检测方向是跟踪肿瘤，需要检测越来越多的基因，但可能抓住T细胞效果更好，是以不变应万变的策略。“T细胞身上有识别肿瘤的钥匙，是否可以借助T细胞达到深入全面了解肿瘤的目的呢？这把钥匙是真正的Holy Grail（圣杯），其应用可覆盖精准免疫治疗与精准预防，用于制备治疗性疫苗的蛋白质工程和肿瘤早期发现”。恒特基因的PANO-Seq^{^®}全景测序将致力于实现该目标，开展对T细胞的深入研究。

总体而言，恒特基因利用PANO-Seq^{^®}全景测序技术向两大方向持续发展，一个是肿瘤病理检测，指导用药检测、伴随诊断和肿瘤早筛检测等应用；另一个方向是致力于提高基因治疗、细胞疗法的安全性，为临床治疗提供更安全的保障。

恒特基因CEO坦言，作为具有多年海外生命科学管理工作经验的资深人士，他对恒特基因发展有非常清晰的认识。恒特基因今后将致力于为企业机构提供高质量产品和技术服务，眼光不局限国内，更放眼全球市场，参与国际竞争，力争让恒特基因成肿瘤防治，精准测序行业的领头羊。

转自贝壳社，作者张楠

前期沉淀

Helicobacter Genetic variation in a4GnT in relation to Helicobacter pylori serology and gastric cancer risk （2009）

Plos One Is there a link between the lipopolysaccharide of Helicobacter pylori gastric MALT lymphoma associated strains and lymphoma pathogenesis? （2009）

Cancer Causes Control A comprehensive analysis of common genetic variation in MUC1, MUC5AC, MUC6 genes and risk of stomach cancer （2010）

Nucleic Acids Res Titration-free massively parallel pyrosequencing using trace amounts of starting material（2010）

Plos One A method for metagenomics of Helicobacter pylori from archived formalin-fixed gastric biopsies permitting longitudinal studies of carcinogenic risk（2011）

Nat Protoc Titration-free 454 sequencing using Y adapters (2011)

Plos One Rapid screening of complex DNA samples by single-molecule amplification and sequencing （2011）

J Clin Endocrinol Metab Identification of oncogenic mutations and gene fusions in the follicular variant of papillary thyroid carcinoma （2014）

Plos One LIN28 is involved in glioma carcinogenesis and predicts outcomes of glioblastoma multiforme patients （2014）

J Thorac Oncol A novel fusion of TPR and ALK in lung adenocarcinoma （2014）

Science Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility （2014）

Nat Med Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing （2014）

N Engl J Med Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer （2014）

J Mol Diagn High p53 protein expression in therapy-related myeloid neoplasms is associated with adverse karyotype and poor outcome （2015）

J Mol Diagn Detection of dual IDH1 and IDH2 mMutations by targeted next-generation sequencing in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes （2015）

Endocr Relat Cancer Identification of insertions in PTEN and TP53 in anaplastic thyroid carcinoma with angiogenic brain metastasis (2015)

Clin Chem Variant profiling of candidate genes in pancreatic ductal adenocarcinoma （2015）

J Thorac Oncol Durable clinical response to Entrectinib in NTRK1-rearranged non-small cell lung cancer （2015）

J Thorac Oncol Unique genetic and survival characteristics of invasive mucinous adenocarcinoma of the lung (2015)

Nat Biotechnol Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition (2015)

Nat Biotechnol GUIE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases (2015)

Nature Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities (2015)

BMJ Incidence of gastric cancer among patients with gastric precancerous lesions: observational cohort study in a low risk Western population （2015）

Gastrointest Endosc Impact of next-generation sequencing on the clinical diagnosis of pancreatic cysts (2016)

J Mol Diagn Next-generation sequencing and fluorescence in situ hybridization have comparable performance characteristics in the analysis of pancreaticobiliary brushings for malignancy （2016）

Oncologist MET exon 14 skipping in non-small cell lung cancer （2016）

Nature High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects (2016)

J Thorac Dis Unique distribution of programmed death ligand 1 (PD-L1) expression in East Asian non-small cell lung cancer (2017)

Sci Rep Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing apporaches （2017）

NPJ Precis Oncol Clinical and radiographic response following targeting of BCAN-NTRK1 fusion in glioneuronal tumor （2017）

JCO Precis Oncol Successful targeted therapy of refractory pediatric ETV6-NTRK3 fusion-positive secretory breast carcinoma （2017）

JCO Precis Oncol Dramatic response to crizotinib in a patient with lung cancer positive for an HLA-DRB1-MET gene fusion （2017）

Nat Med Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients （2017）

Nature Recurrent and functional regulatory mutations in breast cancer （2017）

J Mol Diagn Molecular analysis of gene fusions in bone and soft tissue tumors by Anchored Multiplex PCR-based targeted next-generation sequencing （2018）

J Thorac Oncol Comparison of molecular testing modalities for detection of ROS1 rearrangement in a cohort of positive samples （2018）

JCO Clin Cancer Inform Artificial intelligence approach for variant reporting （2018）

Cancer Discov Expressed gene fusions as frequent drivers of poor outcomes in Hormone Receptor-positive breast cancer （2018）

Appl Immunohistochem Mol Morphol Detection of novel t(12;17)(p12;p13) in relapsed refractory acute myeloid leukemia by Anchored Multiplex PCR (AMP)-based next-generation sequencing（2018）

J Mol Diagn Highly multiplexed fluorescence in situ hybridization for in situ genomics （2019）

Int J Surg Pathol Bone sarcoma with EWSR1-NFATC2 fusion: sarcoma with varied morphology and amplification of fusion gene distinct from Ewing sarcoma （2019）

Proc Natl Acad Sci U S A Rationally engineered Staphylococcus aureus Cas9 nucleases with high genome-wide specificity（2019）

Ann Oncol ESMO recommendations on the standard methods to detect NTRK fusions in daily practice and clinical research （2019）

Nat Methods Combinatorial mutagenesis en masse optimizes the genome editing activities of SpCas9 （2019）

Signal Transduct Target Ther Cancer-associated histone mutation H2BG53D disrupts DNA-histone octamer interaction and promotes oncogenic phenotypes（2020）

Transl Oncol Integration of whole-exome and anchored PCR-based next generation sequencing significantly increases detection of actionable alterations in precision oncology （2020）

Cell Rep A three-way combinatorial CRISPR screen for analyzing interactions among druggable targets （2020）

学术成果

Clin Chem Simultaneous detection of gene fusions and base mutations in cancer tissue biopsies by sequencing dual nucleic acid templates in unified reaction (2020)

J Thorac Oncol Intergenic breakpoints identified by DNA sequencing confound targetable kinase fusion detection in NSCLC (2020)

J Thorac Oncol Potential unreliability of uncommon ALK/ROS1/RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targeted therapy in NSCLC (2020)

J Thorac Oncol Uncommon gene fusions detected at the DNA level necessitate orthogonal diagnosis methods prior to targeted therapy (2021)

合作模式：科研项目数据挖掘；临床合作数据挖掘；临床多中心数据共享；药厂合作临床试验入组；药厂合作伴随诊断；大数据挖掘联合培养

2013年，郑宗立博士在哈佛医学院麻省总医院工作期间发明了肿瘤基因检测技术--AMP（锚定多重PCR法）技术，其兼具杂交捕获法检测全面精度高和超多重PCR操作简便灵敏度高的优势，迅速在美国的顶级医院麻省总医院（综合排名多年全美第一）得以推广，成为该医院主要的肿瘤分子检测手段。该发明于2016年11月获得美国专利局专利，当时率先采用的一些关键技术（如单分子标记除重、多区域标签等）直至今日仍只有少数厂家能成熟掌握。

2017年，郑宗立博士带领的海外归国团队创立恒特基因公司并开发了PANO-Seq全景测序是新一代的原创肿瘤测序技术平台，性能全面优于AMP。

基因融合与肿瘤精准诊疗

2020CSCO丨融合基因变异型肺癌的临床精准诊疗的进展

【突破】RNA+DNA同时测序，检测癌症组织中的基因融合和碱基突变！

NGS接龙丨恒特基因首席科学家郑宗立：专注肿瘤测序，加速技术创新

测序百家丨恒特基因联合创始人郑宗立博士：聚焦基因融合，拓展精准医疗应用范围

PANO-Seq®技术与融合变异系列丨首例亚裔HLA-DRB1-MET融合病例

全能产品！恒特基因推出首个肿瘤检测产品——PANO-Seq®LBC Panel

肺癌指南

NCCN丨非小细胞肺癌临床实践指南2021.1版①（中文）

NCCN丨非小细胞肺癌临床实践指南2021.1版②（中文）

CSCO丨非小细胞肺癌诊疗指南（2020）