基因融合与肿瘤精准诊疗

恒特基因CTO陈力博士

大家对精准治疗、靶向治疗、免疫治疗这些名词都耳熟能详了，但在精准治疗之前情况是怎样的呢？在这之前，一个病人在入院的时候是没有做基因检测的，往往是靠收集一些简单的临床信息，采集切片组织进行常规的病理检查，就可以制定治疗方案。而进入到精准治疗的时代，组织样本不仅要用于常规的病理检查，还要用于分子病理，进入了基因检测的范畴。获得的分子病理信息可以用来指导靶向治疗，希腊神话里叫“阿基里斯的脚后跟”，中文可以称为命门。分子病理就是要找到这个用于治疗的靶点。基因检测以适用人群大概可以划分成一个金字塔。最底层基数最大的是普通人群的健康咨询或者娱乐市场，说实话必要性不是很强。在这之上的层级是高危人群，由于遗传、年龄，或者生活习惯等原因，更易于罹患肿瘤，这是早期筛查所关注的领域。再之上是病理人群，也就是患者，要达到临床确诊、指导治疗、复发监控这些目的，这个是我们目前所关注的。 

肿瘤是一组基因变异导致的疾病。在此我尽量避免使用突变而是使用变异这个词，因为遗传学上的突变指的是狭义的碱基替换或增减，而变异的范围要大得多，像点突变SNV，插入缺失突变Indel，DNA拷贝数变异CNV（比如EGFR基因的扩增），RNA的表达量变化（例如HER2的表达，PD-1、PD-L1的表达）。这里要题外澄清一下，目前指导免疫检查点治疗所用的PD-1/PD-L1表达量是蛋白指标而不是RNA指标。相对这些变异而言，更复杂更重要的变异是基因融合。我们都喜欢开美国政治人物的玩笑，我不知道大家是否熟悉这位人物，他是小布什时代的国防部长拉姆斯菲尔德。在国防部的一个记者招待会上，被询问到有没有在伊拉克发现化学武器这个问题时，他给了一个四平八稳的答案：“我们感兴趣的是那些关于未发生事件的报告；有些事情是已知的已知，有些是已知的未知，还有一些则是未知的未知；如果我们看得更长远的话，未知的未知对我们来说是最困难的也是最感兴趣的。”这段“名言”被改成了诗作，名字就叫做“The Unknown” (莫须有)。套用这个概念，临床样本的基因检测，尤其是基因融合，也是未知的未知。因为融合除了原癌基因外，还牵涉到另外的融合伙伴，存在于全基因组的范围；而且融合的拼接点也不易定位，是一个开放性的问题。

很多人以为基因融合只在各种变异中占了很小的部分，是次要的。比如常见的ALK可能是5%-10%，远比不上EGFR突变30%-50%的水平。但从靶向治疗这个历史维度来看，基因融合是非常重要的。先回顾一下靶向治疗的历史吧：第一个靶向药伊马替尼针对的靶点是BCR-ABL，是发生在BCR基因和ABL1基因间的融合，源于第22号和第9号染色体重排造成的“费城染色体”，这是开创了靶向治疗先河的一个事件；在这之后，EGFR扩增及突变成为非小细胞肺癌的第一个靶点，是一个超级靶点；而随后FDA批准的非小细胞肺癌的第二个和第三个靶点是ALK和ROS1，都是基因融合；再谈到最近的一个热门靶点NTRK，在肺癌中比例非常低，高加索人群如果没有经过筛选的话大概在千分之一左右，国内也只有零星报道。但是这个靶点又非常重要，现在的靶向药研发重点两个药，一个是LOXO，专门针对NTRK1，第二个是Ignyta公司的，更广谱一些，除了NTRK1也针对ALK和ROS1，这两个还在开发的靶向药最近获得了14亿和17亿美元的转让费。

这里我向大家介绍为融合靶向治疗作出突出贡献的John Iafrate教授，MGH麻省总医院癌症中心分子病理科主任，也是恒特基因聘请的科学顾问。先看他做的一件事情：2007年，一群日本学者在非小细胞肺癌中发现了EML4-ALK基因融合，而ALK 是一个受体酪氨酸激酶。John Iafrate立刻就想到辉瑞正在研究的一个广谱的酪氨酸激酶抑制剂。他迅速开发了一个用FISH检测ALK融合的方法，在他治疗的患者当中找到了一例ALK融合，加入到正在进行的临床试验中。这个临床试验最初目的并不是针对非小细胞肺癌，而是针对食管癌以MET基因为靶点。这个病人治疗14天后肿瘤神奇地消退了。这是第一例非小细胞肺癌ALK经过克唑替尼治疗的例子，时间是2008年。他随后进行了一组单臂临床试验，不设定对照组，取得了非常好的效果，大多数病人的肿瘤都有显著缩小。文章发表在2010年的N Engl J Med上，2011年FDA根据这个无对照组临床试验的结果批准了克唑替尼用于非小细胞肺癌ALK阳性患者的治疗，而他撰写的ALK 融合FISH检测规范也被FDA采纳。从事药物研发的都知道，一个药从前体分子一直做到完成临床试验获批，能在10年完成是非常顺利的了。而克唑替尼仅用了4年时间，起点从一篇科研文章发现靶点算起，可谓神速。

一次还可以说是偶然，第二次就不是运气而是素质了。小布什是怎么说来着：”Fool me once, shame on...shame on you. Fool me… you can’t get fooled again.” 嗯，离题了。Iafrate教授就把同样的事情做了第二遍。刚才说过克唑替尼是广谱的酪氨酸激酶抑制剂，John想到1987年有一篇文章提到胶质母细胞瘤中发现过ROS1基因的重排（即融合），那么非小细胞肺癌中是不是也有ROS1融合可用作克唑替尼的靶点呢？他“又”开发了一个FISH方法判断ROS1融合并在2009年找到一例阳性病例，“双”进行了首例治疗和一组疗效显著的单臂临床试验，“叒”发表在新英格兰医学杂志上，然后“叕”被FDA批准。这一系列事件就体现出他极强的思辨能力，能够从零星的事件中发现其内在联系；渊博的学识，能够回顾到20年前的文章；卓越的领导力，能够开创性设计并快速推进临床试验。正是由于他的突出贡献，漫长的过程被显著缩短了。从此，克唑替尼被广泛应用于ALK和ROS1融合的靶向治疗。

接着我们来说检测融合的方法。常规检测方法，针对NGS高通量测序而言，有很多的局限性。第一种是免疫组化 (IHC)，缺陷是适用范围窄，比如可用于肺癌中ALK的检测，肺组织中ALK的正常表达量是很低的，而一旦发生融合，带动了融合基因的表达量增加，所以可以用免疫组化 (IHC)测ALK蛋白的水平评估是否发生融合，但这个方法就不适合基础表达较高的ROS1基因了。第二种是荧光原位杂交（FISH），缺陷是分辨率比较差，因为它是用光学方法去观察空间距离的，和分子水平相差不止一个量级，另外也无法知道融合伙伴是谁，只对融合是否发生这个问题给出是或否的答案。第三个方法是反转录PCR（RT-PCR），缺陷是一般需要预知融合伙伴，这样才能设计出有针对性的PCR引物。

高通量测序改变了基因检测的生态。左边这张图大家都非常熟悉，测序的成本随时间稳定下降，呈现类似摩尔定律的速率，直到2008年高通量测序广泛应用，测序成本出现了断崖式下降。高通量测序的应用方案很多，如全基因组测序、外显子组测序、靶向测序等等，但按目的可简单分为两种，一种是拼接，就是把随机分布的短序列拼接成一条连续的长序列， 第二种是定点的深度比对，只针对某一些点或者某一段区域。

高通量测序应用到临床面临一些问题。实验室做科研课题可以选择理想的条件，高品质的标本，多次反复，但临床检测不行。临床检测有很多现实的要求，比如说样本品质，很多样本是库存的石蜡切片，首先经过福尔马林的浸泡使蛋白及核酸固定交联，然后包埋在石蜡里面，在室温下可能放置了好几年，这样折腾下来核酸也给破坏得差不多了。其次需要采用定点高深度测序，只对目标基因密集检测，因为肿瘤相关基因毕竟有限，而肿瘤样本来自体细胞，具有异质性，不是每一个细胞都相同，只有一部分细胞（或基因组拷贝）是变异的，术语称为“丰度”或“等位基因频率”，在实体病理组织中可能低到1%，游离核酸中可能更低，只有测得深才有机会抓住这些变异的拷贝。第三个要求就是开放，也就是刚才所说的未知的未知这个概念，可以检测各种变异，可以获得完整的融合信息。除此之外还有各种技术性能指标，比如均一性、灵敏度、特异性这些。还要做得快，这是目前NGS相比传统方法的缺陷，实验操作和数据分析都很耗时。还有样本消耗量要低，因为样本往往取材有限，不希望被检测消耗掉，或者样本太少达不到检测要求，对病人来说都不是正面的答案。

在此介绍两个NGS定点深度测序技术，都是恒特基因的联合创始人及首席科学家郑宗立博士发明的。第一个是AMP锚定多重扩增技术，文章发表在2014年的Nat Med上。它可以使用DNA或者RNA为模板，第一步先把RNA反转录为cDNA，然后连接加接头，随后进行两次特异性扩增，以一端的基因特异性引物和另外一端的接头引物扩增。正是因为这种设计，它对未知的融合伙伴开放。当时最多做到1400重，有1400个不同的区域被同时富集扩增。右边是用AMP检测基因融合的例子，表现了CD74-ROS1的融合，以及两例新型的NTRK1融合。

我们说AMP显示出超越临床“金标准”的性能，这个临床金标准是什么呢？就是郑博士当时的导师John Iafrate教授开发的FISH法，FDA把它做为标准。这篇论文的数据表现出AMP比FISH还要好。红色框部分是ROS1的融合检测，使用FISH方法检测出了23例的阳性，都被AMP判断为阳性，使用FISH法检测出172例阴性也全部被AMP 判为阴性，临床灵敏度和特异性都达到100%，完全吻合。除此之外，两例FISH检测无法确定的，一例被AMP 判为阳性，有明确的位点序列支持，另外一例是被AMP判为阴性，而这一例也加入了2014年ROS1单臂临床试验，使用克唑替尼治疗无效，说明AMP的阴性判断是正确的，从这个角度而言AMP超越了临床的金标准。

AMP 技术2011年开始开发，在2013年进入MGH临床使用，半年左右替代了其他的分子检测方法，成为MGH主要的肿瘤基因检测手段。到2015年郑博士离开MGH的时候，这个医院已经检测了超过一万例病例。AMP也通过ArcherDx公司实现了商业化，也被很多第三方权威机构认可。比如纽约的斯隆凯特林中心MSKCC，去年发表的一万例大样本的临床数据，论文的方法部分就提到测突变使用基于杂交捕获的MSK-IMPACT 技术，而检测疑难融合则采用Archer的AMP。

恒特目前使用的是郑博士发明的新一代技术，称为PANO-Seq全景测序（Parallel Amplification Numerically Optimized Sequencing,平行扩增数字优化测序）技术。它有两个特点，平行扩增，比原先的AMP均一性更好；数字优化，使用了UMI（单分子条码）数字标签和核酸模版的多种信息。

PANO-Seq和其他的技术相比优势体现在哪里呢？回到开头说的概念，临床样本在检测前是“未知的未知”。拿到一个样本的时候，需要回答的是“有什么变异”这个开放性的问题，而不是“是否有某个变异”这样的选择题。刚才说过，变异的类型主要有五种：点突变，DNA拷贝，插入\缺失，融合还有表达 。适合检测各种变异的核酸模版是不一样的，像点突变、DNA拷贝、插入\缺失要以DNA为模版进行检测，而融合和RNA表达更适合使用RNA为模板来进行检测。PANO-Seq的特点是同时检测两种核酸，在检测的过程中操作者完全不用区分是DNA还是RNA，从一个标本起步，从头到尾不分离样本，提取的是总核酸，甚至给它取了一个名字叫TNA，Total Nucleic Acid，总核酸建库、上机测序都是一管。等拿到测序数据后再使用分析软件进行数字区分。这个技术据我所知应该是独步的。AMP则是把RNA和DNA分开检测，Archer公司有两个产品线，FUSIONPlex用RNA测融合，VARIANTPlex用DNA进行点突变检测，把标本当作两个文库处理，最后汇总报告。除此之外还有一些方法，基本只能使用一种核酸模版，以DNA为主，可以检测点突变，插入\缺失，但融合往往做不好，因为DNA的模版上融合断点分布范围广，还要考虑读码框和是否形成转录表型等一系列问题，测序量大且分析困难。

我们也做了一些试剂盒，之前推出一个“LBC肺癌乳腺癌结直肠癌”panel，目前正在开发的是Lung FusionPlus（肺癌融合+）试剂盒，它的设计理念是把NCCN（美国国家癌症中心网络）推荐的核心及新兴生物标志物都放进去了。Panel并不大，基因数不算很多，但贴合临床需求，使用灵活，以检测融合为主，也可以检测点突变和插入\缺失突变，也在尝试诸如NTRK这样的网红变异。

除此之外，我们也建立了一整套的辅助产品。除主要产品PANO-Seq外，核酸提取叫做PANO-Pure，用于质控的叫做PANO-Sure，都各有特点，比如质控试剂不止衡量核酸的浓度，还分别评估DNA和RNA的质量是否符合建库要求。分析软件叫做PANO-Call，整合了样本拆分、模版拆分、变异判定和注释的功能。

来看一例使用PANO-Call的SplitFusion模组进行融合分析的结果，在一个常见的EML4-ALK基因融合案例中发现了四个分隔序列，第一第二个来自EML4外显子，第四序列来自ALK外显子，比较好解释，第三个序列来自EML4的内含子，表明RNA转录产物中有一个隐蔽的剪切点，这种情况用DNA检测和其它软件可能就发现不了。

测DNA突变的性能同样优秀。这张图左边是从做突变标准品的 Horizon Discovery 公司网站上的截图，说明不同用户使用Thermo公司的AmpliSeq技术检测一个标准品的情况，AmpliSeq是一个广泛采用的常规多重扩增法。可见很多场合都没有检测出来，包括一个达到5%比例的KRAS基因。右边是同样的标准品我们进行了6次PANO-Seq检测，三次使用50ng标准用量的核酸，另外三次只用了10ng的较低量，全部检测出来了。

再谈一些罕见的融合病例，比如NTRK。开始说过两家公司，LOXO公司的LOXO-101（Larotrectinib）和Ignyta公司的Entrectinib。Ignyta的合作伙伴就是使用 AMP技术的ArcherDx，共同推进NGS伴随诊断试剂的开发。

NTRK在国内检测出来的案例凤毛麟角。在国外一般认为在肺癌中是千分之一，我给大家展示过郑博士发现的两例NTRK1。这里还有一些他发现的病例：在胶质神经瘤中发现的一例NTRK1；黏液性肺腺癌中发现的TPM3-NTRK1；非小细胞肺癌中的NTRK1 融合与治疗。最后一个案例是NTRK3融合，是其它学者使用AMP方法检出的。AMP能够检测NTRK是广为认可的，而PANO-Seq还没有发现NTRK阳性病例，做的病例还不够多，但相信这只是一个时间问题。

最后，以恒特基因和中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）合作的课题做为结尾。这个项目收纳了约一千例肺癌样本，目的是发现其它方法容易漏检的变异，尤其是基因融合。我们也给自己出个难题，使用一些长期库存RNA降解严重的样本，想了解这个方法对RNA品质的容忍度如何。这个项目正在进行中，发现了很多像ALK、ROS1、RET这样的融合，以及EGFR、BRAF、KRAS这些基因的突变。同时也发现了一些非常罕见的病例，我相信从这个项目可以发现很多有意义的东西。

关于恒特基因

肿瘤防治，精准测序。恒特基因专注于肿瘤医疗领域的高通量测序检测，利用独有的平行扩增数字优化测序（PANO-Seq®全景测序）高精度建库方案，提供可靠有效的产品应用。恒特业务重点为对肿瘤病因及治疗具有重要意义而又难以检测的基因突变类型-基因融合，并同步检测其它多种类型突变。公司位于深圳，详情请访问 www.helitecbio.com。

Precision Cancer Sequencing. HeliTec is a research-based biomedical company focusing on development and medical application of next-generation sequencing in tumor diagnosis. HeliTec provides reliable and efficient gene mutation detection solutions based on proprietary Parallel Amplification Numerically Optimized Sequencing (PANO-Seq) technology. We emphasize gene fusion, a hard-to-detect mutation type that is critical for tumor ontology, progression and treatment, and simultaneously detect other mutation types. HeliTec is headquartered in ShenZhen. For details please visitwww.helitecbio.com.

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