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Hum Gene Ther |一决高下!AAVs和LV病毒载体脑室注射感染效率比较

莜莜筱莜莜 和元生物 2022-04-17
抑郁症、阿尔茨海默症和精神分裂症等一些神经系统疾病给个人、家庭及社会带来了沉重的负担。过去的研究发现,抑郁症模型猴脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中的代谢产物和蛋白质发生了改变,且在抑郁症患者脉络丛组织(The choroid plexus, CP)中也发现了基因的变化[1-3]。最近的一项研究表明,具有精神病家族史的患者脑内脉络丛组织体积增加[4],提示了脉络丛组织在整个精神病谱系中具有潜在的病理生理机制,然而,其具体作用尚不清楚。

脉络丛,位于脑室的一定部位,由软脑膜及其上的血管与室管膜上皮共同构成,其中有些部位血管反复分支成丛,连同其表面的软脑膜和室管膜上皮一起突入脑室而形成脉络丛,为产生脑脊液的结构。脉络丛组织中的多肽和蛋白的分泌也会影响血液和CSF成分[5]。因此,对脉络丛组织进行基因操作是揭示其在神经系统疾病中作用机制的一种重要方法。

病毒载体介导基因水平操作已成为神经科研研究的主流技术,为更好的研究脉络丛组织的功能,2020年4月16日,谢鹏教授、程可博士团队在《Human Gene Therapy》期刊合作发表题为“Different Serotypes of Adeno-Associated Virus Vector- and Lentivirus-Mediated Tropism in Choroid Plexus by Intracerebroventricular Delivery”的报道[6]。文中作者比较了六种不同血清型的AAV和慢病毒载体通过脑室注射(intracerebroventricularly, ICV)方式感染脉络丛组织的效率,为后续对脉络丛组织进行基因操作提供了理论支持。


基于这项研究潜在的应用价值,本论文为《Human Gene Therapy》杂志封面发表。



重组腺相关病毒载体(Recombination adeno-associated virus, rAAV)


是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体,具有免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等优势,被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。rAAV载体种类多样,有众多血清型,不同血清型的rAAV载体可以识别不同的细胞表面受体,表现出不同组织或细胞感染嗜亲性。

慢病毒载体(Lentivirus)


是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。它可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主基因组中实现稳定表达。



结果


将基因有效递送至目标组织中是基因研究或是基因治疗成功的第一个关键步骤,因此,在基因递送过程中,对于递送途径的选择是非常重要的。由于脉络丛(The choroid plexus, CP)组织特殊的结构,增加了病毒载体局部注射的难度,此外,不同的注射方式对病毒扩散效率也不同。
为感染脉络丛,作者将构建好的六种不同血清型的AAV和慢病毒(表1)载体通过脑室注射(intracerebroventricularly, ICV)方式注射小鼠右侧脑室。病毒表达21天后对大脑切片进行成像观察。结果显示,通过ICV注射rAAV2/1、rAAV2/5和rAAV2/8的小鼠脉络丛组织有较强的荧光信号;rAAV2/9和慢病毒载体感染脉络丛组织荧光较弱;注射rAAV2-BR1和rAAV2-PHP.eB病毒载体,小鼠脉络丛组织中无明显荧光蛋白表达(图1)。

表1 载体列表


图1 不同病毒载体通过ICV注射对脉络丛感染效率及全脑图


此外,DAPI共染结果显示,在第三脑室和侧脑室的室管膜细胞及脉络丛细胞均发现由rAAV2/1载体介导的EGFP表达(图2a)。然而,rAAV2/5和rAAV2/8介导的GFP只特异性表达在脉络丛细胞中(图2b,c)。同时,慢病毒也能有效感染脉络丛细胞,不过,其感染强度不如上述AAV病毒(图2d)。


图2 rAAV2/1、rAAV2/5、rAAV2/8和慢病毒感染脉络丛特点


基于上述结果,作者进一步验证rAAV2/5载体感染脉络丛组织特点。Western blotting结果显示,ICV途径注射rAAV2/5载体只特异性感染脉络丛组织(图3a,b)。此外,TTR(脉络丛上皮细胞marker)免疫荧光结果提示了,rAAV2/5可以感染脉络丛上皮细胞(图3c,d)。
在基因递送过程中,需要了解递送的基因是否以高浓度定位于目标组织,同时使用ICV注射时需要考虑脑脊液对病毒载体滴度的影响。基于此,作者分别检测了不同剂量和表达时间对于rAAV2/5感染效率的影响。研究人员将不同剂量(4.55x1010 VG、1.37 x1011 VG 和2.28 x1011VG)的rAAV2/5-CMV-EGFP-2A-MCS-3FLAG通过ICV途径注射小鼠小鼠右侧脑室,发现rAAV2/5载体感染脉络丛组织存在剂量依赖性(图3d)。同时,4.55x1010 VG 总量的rAAV2/5载体感染小鼠6个月后,在侧脑室和第三脑室仍发现明显的EGFP荧光信号(图2e),提示了rAAV2/5病毒载体携带的基因在脉络丛组织可以长期、稳定的表达。


图3 rAAV2/5载体感染脉络丛组织特点


近年来,基因治疗作为全球最引人注目的新型疗法快速发展,目前已累计超过3000种基因治疗产品投入临床试验(数据来源:ClinicalTrial),包括Glybera, Strimvelis, Luxturna, Zolgensma以及Zynteglo在内的数款基因治疗产品也已陆续上市。rAAV作为基因治疗的明星载体,一直是人们广泛关注的重点。本项研究的结果显示rAAV2/5和rAAV2/8可以作为在脉络丛组织递送基因的有效工具载体,提示了rAAV载体介导的基因治疗脉络丛病变类疾病的可行性,为此类疾病的治疗提供了新的策略。


和元上海有幸提供实验中使用的全部工具病毒载体,用实际行动助力中国脑科学的发展。


得益于rAAV病毒载体的发展,借助rAAV在体内进行基因水平或者生理水平的操作已成为科学研究的主流技术。rAAV有非常多的血清型,现在研究中常用的rAAV病毒载体就是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体,一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。重组的病毒具有AAV2型的稳定表达和基因整合能力,同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性(不同血清型衣壳表面的特定结构位点决定了各自受体的特异性),表现出一定的器官靶向特异性。如您不确定选择哪种血清型,可尝试使用和元上海Pandora’s Virus (rAAV试用装) 进行预实验,通过比较不同血清型对目标组织的感染效果,摸索最佳实验条件(注射方法、注射位点、病毒用量等),以便得到更理想的实验结果。


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参考文献:

[1] Deng FL, Pan JX, Zheng P et al. Metabonomics reveals peripheral and central shortchain fatty acid and amino acid dysfunction in a naturally occurring depressive model of macaques. Neuropsychiatric disease and treatment 2019;15:1077-1088.

[2] Qin Y, Jiang X, Li W et al. Chronic mild stress leads to aberrant glucose energy metabolism in depressed Macaca fascicularis models. Psychoneuroendocrinology 2019;107:59-69.

[3] Turner CA, Thompson RC, Bunney WE et al. Altered choroid plexus gene expression in major depressive disorder. Frontiers in human neuroscience 2014;8:238.

[4] Lizano P, Lutz O, Ling G et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. The American journal of psychiatry 2019:appiajp201918070825.

[5] Ransohoff RM. Physiology. Good barriers make good neighbors. Science (New York, NY) 2014;346:36-37.

[6] Chen X et al. Different Serotypes of Adeno-Associated Virus Vector- and Lentivirus-Mediated Tropism in Choroid Plexus by Intracerebroventricular Delivery. Hum Gene Ther. https://doi.org/10.1089/hum.2019.300

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