改善基于mRNA的CAR-T生产工艺，“在体CAR”是否是康庄大道？

CAR-T疗法一向以“血液肿瘤特效药”、“天价药”的标签闻名遐迩。这种疗法成本巨大，制备时间长，急需技术层面的优化升级，实现“降本增效”以普及更多患者。体外CAR-T的生产制备，除了原代T细胞的活化与扩增，其核心还在于实现CAR在T细胞上的表达，这一步通常需要利用到载体将编码CAR的基因导入T细胞。然而，现有的一些体外功能性CAR-T细胞生产方案都不具备时间和成本效益。

因此，有越来越多的CAR-T企业，诸如诺华Novartis，开始采用mRNA技术生产CAR-T，临床表现出了更高的生物水平安全性与时间成本效益。在此基础上，“CAR-T 之父”Carl June与mRNA 技术奠基性人物 Drew Weissman等行业领军人物开创了mRNA转染在体CAR，在体内制备功能性CAR-T细胞治疗心脏损伤的技术应用^[1]，初步显示该技术在多维度上的优势与前景。

传统CAR-T局限依旧

UCAR-T应运而生

传统CAR-T疗法，首先需要从患者的血液中提取T细胞，并进行特定的基因修饰编程，增强其靶向和杀死癌细胞的能力。再将修饰后的T细胞在体外大量培养，最后输回患者体内。可以说，CAR-T细胞疗法自被提出以来，就一跃成为了治疗癌症的明星疗法。网传“120万抗癌神药”其实就是一种“CAR-T细胞”静脉注射液。然而，传统CAR-T疗法体外制备流程复杂，耗时较长，成药后仍有细胞因子释放综合征及神经系统毒性等不良反应产生。同时高昂的研发制备成本让许多患者望而却步，且对实体瘤作用依旧匮乏，普及能力较差。

以法国公司Cellectis、Allogene和亘喜为代表的Biotech公司，致力于开发“现货型”CAR-T产品，旨在降低生产成本，缩短治疗窗口，能更好的惠及广大患者。其仰赖的同种异体CAR-T技术也被称为“UCAR-T”，被业内认为是开创了“CAR2.0”时代的标志技术。

与传统制备流程不同的是，UCAR-T是从健康供体体内分离T淋巴细胞，通过病毒载体将CAR基因和其他基因（如自杀基因和共刺激受体等）转导入T细胞中，并利用基因编辑技术敲除会引起移植物抗宿主反应（GvHD）和免疫系统排斥的相关基因（TCRHLA等），然后使用细胞因子等刺激扩增T细胞，并基于磁珠技术分离出特定的T细胞亚群。

图：传统CAR-T制备流程

“降本增效”

mRNA技术仍是答案

在实现体外制备技术“降本增效”的路上不断地有研究者砥砺前行。其实早在CAR-T疗法初露锋芒的时期，以诺华、Cartesian Therapeutics为首的一些公司就开始使用mRNA技术体外制备工程化CAR-T，并得到了更好的安全性数据与时间、生产成本上的显著效益。

传统CAR-T的转染，通常使用质粒作为CAR基因载体进入T细胞细胞核，然后转录成mRNA。mRNA继而被释放到T细胞细胞质中并表达CAR和相关有效蛋白质。因此，质粒的传递比直接的mRNA传递要慢，并带来了时间效益的挑战。

更重要的是，CD19导向的CAR-T细胞靶向癌变B细胞和正常B细胞，所有CD19阳性细胞的消除可能导致B细胞发育不全。这是由于，质粒传递的CAR-T细胞将显示出永久的CAR表达并在每个细胞分裂周期后依旧保持CAR表达。由于外源遗传物质的插入和免疫原性，将新基因组整合到宿主细胞核中将引发一系列安全问题。

与质粒相比，mRNA允许CAR的短暂表达，不需要基因组整合，并有可能引起更少的不良反应。不仅如此，大多数合成mRNA分子可以快速设计并以具备成本效益的方式大量生产，可大大缩短制备周期。

此外，传递到T细胞的mRNA数量可以影响T细胞中CAR的表达水平，表明基于mRNA的CAR表达可能提供了一种调节CAR-T细胞治疗相关副作用的调控机制。利用mRNA生产CAR-T细胞已逐渐成为已批准CAR-T产品生产的的替代方案。

近日，来自弗劳恩霍夫细胞治疗和免疫学研究所IZI的研究团队在Scientific Reports上发表了题为“How to improve mRNA-based CAR-T cell generation and functionality? A lab-scale comparison（如何改善基于mRNA的CAR-T细胞生成和功能？实验室规模的比较）”^[2]的文章。该文章通过对常规生产参数的调整，提出了两种优化方案，为mRNA制备CAR-T的工艺流程升级提供参考。

弗劳恩霍夫细胞治疗和免疫学研究所IZI

Fraunhofer IZI与生物技术，制药和医学工程领域的公司，医院，诊断实验室和研究机构进行合作研究，在细胞和基因治疗、药物和疫苗、分子诊断和免疫诊断以及体外治疗等业务领域，坚持开发、优化和验证各类方法、材料和产品。其专业领域包括细胞生物学、免疫学、药物生化学、生物分析以及工艺开发和产业化，主要研究集中在免疫肿瘤学和传染病病理学的发展上。据悉，诺华Novartis的CAR-T疗法研发生产相关业务已与Fraunhofer IZI合作多年。

文章指出，高质量mRNA CAR-T细胞产品必须满足三条基本标准：

（1）保证转染前T细胞的高数量与高活力，大量高活的T细胞对于CAR-T的质量尤为重要。目前的制造工艺使用患者来源的T细胞，这些T细胞大多经过大量预处理，T细胞质量差，无法短时间内获得大量高活性的样本。

（2）mRNA应在T细胞活化后第6天至第10天之间递送。在患者白细胞去除术后，mRNA转染前增加6-10天的预扩增处理相比于没有该步骤的，显示出更有利于成品CAR-T细胞的活性和功能性的表征数据，而超过10天的T细胞活性开始下降。该结果表明，T细胞培养中，使T细胞经预扩增后更成熟稳定，对产品的质量也至关重要。

（3）CAR-T细胞功能化过程对于高效杀伤靶细胞同样重要。通过更高的CD8：CD4比率，可以促进更快速有效的细胞毒性。对于病毒转导的CAR-T细胞，CD4 CAR-T细胞最初表现出比CD8更慢的肿瘤杀伤速度，但也因此更不易耗尽，在体内起效更持久。然而，这些因素在短效CAR-T细胞中不构成问题。mRNA-CAR-T细胞的瞬时性质需要快速有效的肿瘤杀伤，因此需要高水平的CD8阳性细胞。由于mRNA的半衰期短和短效CAR表达，不需要考虑CAR-T细胞的长期持久性，也可以避免过表达引起的细胞因子释放综合征。

本文中的mRNA转染依赖于电穿孔，但该团队经比较实验后认为，基于LNP的转染方式可能是更好的实验室规模可放大的制备工艺。据悉，相关的比较研究文章正在发表准备中。

图：Fraunhofer IZI的生产流程

来自加州大学的Abraham Lee研究团队在预印本bioRxiv上发表了题为“Titering of Chimeric Antigen Receptors on CAR T Cells enabled by a Microfluidic-based Dosage-Controlled Intracellular mRNA Delivery Platform（通过基于微流体的细胞内mRNA递送平台实现CAR-T细胞上嵌合抗原受体的滴度剂量控制）”^[3]的文章。文中展示了该团队的新型声动电切割环绕穿孔平台（Acoustic Electric Shear Orbiting Poration，AESOP)，并与传统电穿孔方式进行了mRNA转染CAR-T的效益比较。

文章指出，传统的引入CAR基因的非病毒方法是进行批量电穿孔，原理是在细胞膜上打开和扩大纳米级的孔。然而，批量电穿孔最开始需要应用一个强电场诱导膜孔的初步形成，而强电场往往将直接损害细胞的生存能力。而AESOP平台使用的是机械剪切初步开孔，并用微电场扩大孔隙。该平台的声微流控将进一步将细胞与mRNA混合，确保均匀有效的摄取传递。除此之外，该团队还进一步提高了细胞处理密度和速度，将每芯片每分钟100万细胞增加到每芯片每分钟300万细胞。

图：AESOP平台处理单元

mRNA与CAR相得益彰

“在体CAR”陆续落地

业内除了在体外CAR-T领域继续挖掘，还将目光望向了除T细胞外的其他免疫细胞，并开发出了例如CAR-NK、CAR-M等的疗法，目标是传统CAR-T无法应对的实体瘤。同时，该两种疗法也伴随着“在体CAR”这一呼声逐渐打开了行业研发的视野。而新冠mRNA疫苗的成功也为我们打开了体内递送mRNA“在体制备CAR-T”的新思路。

2022年1月，“CAR-T 之父”Carl June与mRNA 技术奠基性人物 Drew Weissman共同发表了一项具有里程碑意义的研究，为我们开拓了“在体原位CAR-T”的应用新领域。宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的研究团队利用能够编码CAR的mRNA-LNP递送小鼠体内，成功在体内实现CAR-T细胞的生成并成功修复了小鼠的心脏功能，这意味着在体CAR也将不仅限于肿瘤免疫治疗。在此番研究成果的基础上，细胞疗法公司Capstan Therapeutics脱颖而出，其科学创始人除了Carl June与Drew Weissman外，还包括宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院首席科学家 Jonathan Epstein以及Haig Aghajanian。2022年9月15日，Capstan Therapeutics宣布完成 A 轮融资并正式走出隐匿模式，目前已获得来自辉瑞、拜耳、诺华、礼来和BMS五大制药公司总计超1.65亿美元的融资。

作为mRNA领域的领头企业，Moderna也同样开始在CAR细胞治疗领域发力。2022年1月13日，Moderna就与Carisma宣布建立合作关系，将Carisama的工程巨噬细胞技术与Moderna的mRNA和LNP技术相结合，以开发体内嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）疗法。

国内的远泰生物也在开发mRNA-LNP体内CAR-T/NK，并且在2022 AACR上发布了mRNA-LNP在CAR-T领域的研究进展。除此之外，凯玛生物已布局3条在体CAR-M的管线，通过体内编辑，在体原位生成CAR-M治疗实体瘤。优卡迪生物正在研发利用LNP载体递送IL-6 shRNA和CD19-CAR组合质粒，依靠IL-6敲低达到减少IL-6引起的细胞因子风暴的目的。

总结

4月12日，上海市卫生健康委发布上海最新癌症监测数据。最新监测数据显示，上海全市新发癌症病例9.14万例，发病率为623/10万，发病前三位的癌症依次是肺癌、大肠癌和甲状腺癌；全市有3.83万人因癌症而死亡，死亡率为261/10万，癌症仍是上海市居民的第二位死因。

癌症治疗一直是医疗医药行业不断努力攻坚的领域。CAR-T疗法作为近些年最受关注的细胞疗法之一，在癌症治疗上被持续寄予厚望。然而，目前应用于临床的CAR-T疗法存在多种局限性，普及程度依然很低。尽管以CAR-T为基础的CAR-NK、CAR-M和在体CAR-T百花齐放，但短期内似乎仍有生产、效用上的诸多问题亟待解决。“降本增效”可以说是医药研究的“终极目标”，沉寂多年的mRNA技术异军突起，也为CAR-T疗法的未来发展打开了新的局面。

从2016年以来，我国监管对细胞疗法的政策发布与改变也显示，行业发展已搭上了高速铁路。相信不久的将来，人类将攻克癌症，实现将癌症变为有药可治“慢性病”的愿景。

参考资料

[1] Rurik JG, Tombácz I, Yadegari A, Méndez Fernández PO, Shewale SV, Li L, Kimura T, Soliman OY, Papp TE, Tam YK, Mui BL, Albelda SM, Puré E, June CH, Aghajanian H, Weissman D, Parhiz H, Epstein JA. CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury. Science. 2022 Jan 7;375(6576):91-96. doi: 10.1126/science.abm0594.

[2] Nadine Auw, Robert Serfling, Reni Kitte et al. How to improve mRNA-based CAR-T cell generation and functionality? A lab-scale comparison, 05 April 2023, PREPRINT (Version 1) available at Research Square. doi:10.21203/rs.3.rs-2719850/v1.

[3] Chen YH, Jiang R, Lee AP. Titering of Chimeric Antigen Receptors on CAR T Cells enabled by a Microfluidic-based Dosage-Controlled Intracellular mRNA Delivery Platform. bioRxiv [Preprint]. 2023 Mar 15:2023.03.14.532624. doi: 10.1101/2023.03.14.532624.

E.N.D

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