“精简”生物工艺的技术进步
本文节选自“Technology Advances Streamline Bioprocessing”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
多年来，随着生物制造商努力提高产量、产品回收率、产品纯度以及简化生产流程，生物工艺领域取得了许多进展。上游和下游工艺技术和设备的创新使工艺更加集成和高效，但仍然存在一些生产挑战，需要进一步的创新。
上游进展
成功的上游生物工艺创新集中在数个关键领域，包括：
通过工艺强化（高密度接种补料分批、灌流和连续培养技术）提高单位体积生产力 通过新的细胞表达和诱导技术提高细胞特异性生产力，控制关键产品质量属性(CPQA)，并通过系统生物学加深对分子和细胞生物学的理解 加快整体工艺开发时间线
Catalent Biologics 上游工艺开发总监Brian Follstad 表示：“这些进展使我们能够从细胞系生成快速推进到临床cGMP生产，生物工艺生产效率和可重复性更高。”
Univercells 工艺开发经理Vasily Medvedev 说：“在不同的产品领域，肯定有许多革命性的创新方法。如果我们看看单克隆抗体 (mAb) 的生产，那么多年来看到的关键生物工艺进步之一是使用高细胞密度灌流细胞培养。这项技术减小了所需生物反应器的尺寸，直接影响运营的总体占地、资本支出(CAPEX) 以及随后的商品成本。”
此外，Medvedev说，当这些原则正确应用于工艺开发和规模放大研究时，实验设计 (DoE) 技术的使用是该行业的一个极有希望的趋势。“为了充分受益于DoE 研究的使用，具有代表性的规模缩小模型至关重要，其可确保识别高性能小规模工艺设计并无缝过渡到商业制造规模、缩短开发时间（上市时间）以及降低成本。”
Lonza生物药全球运营主管Thibaud Stoll 回顾了过去五年在上游生物工艺领域出现的新情况，指出了影响生物工艺操作的三项主要创新：
细胞表达系统的持续优化，推动了滴度的持续增加，已经可达到甚至超过10 g/L 水平 一次性生物反应器及相关设备的不断开发和改进 作为生物制造数字化转型一部分的数字化工具的开发
“这些创新有助于在整体上提高工艺的稳健性，降低商品和服务的成本，提高灵活性，以应对快速变化的需求，”Stoll说。
Lonza 制药研发高级总监Atul Mohindra 补充说，其它创新，例如培养基开发、细胞系筛选、宿主细胞系改进、优化载体以及高通量筛选技术的引入，也彻底改变了上游生物工艺以及生物技术。Mohindra还将优化的过程建模工具视为重要的上游创新，这些工具有助于更好地了解细胞培养过程以及开发更先进的技术设备（例如一次性技术[SUT]、在线检测技术）。“这使该行业能够开发更复杂的分子，显著缩短生产首次人体试验批次的时间，并降低开发计划的成本，”Mohindra说。
“除了最新一代的一次性搅拌罐和摇摆(RM) 生物反应器外，近年来推出的最重要的产品之一是交替式切向流(ATF) 过滤，” Sartorius Stedim Biotech全球连续和强化生物制造技术顾问 Gerben Zijlstra 评论道，与以前的方法相比，ATF 提供了更有效和更具成本效益的灌流培养。Zijlstra 补充说：“它对细胞也更温和，从而提高细胞活性，降低了下游工艺的杂质水平。”
“与传统的补料分批工艺相比，这项技术使细胞密度提高了5-10 倍，从而极大地强化了哺乳动物细胞培养，”Zijlstra解释说。通过应用不同的 ATF 过滤器孔径，连续上游生产可以作为动态或连续灌流进行，其中产品透过过滤器并使用连续层析法直接捕获；或者，它也可以作为浓缩补料分批(CFB) 进行，其中产品截留在生物反应器中，并以批次方式收获。“这些强化细胞培养工艺的生产力大大超过了现有的补料分批平台。对于 CFB，据报道滴度约为 30 g/L，而对于动态灌流，据报道滴度为60 g/L（等量计算），”Zijlstra 说。
Sartorius Stedim Biotech 全球连续和强化生物制造技术顾问 Thomas Erdenberger 补充说，最近的另一项创新是多种在线过程分析技术 (PAT) 工具的引入，例如使用电容传感器的细胞密度监测仪。“这些传感器允许对活细胞进行实时细胞密度监测，而无需使用传统方法，冒着污染培养物的风险，通过取样来测量密度。这种新方法允许使用与监控系统相结合的传感器实现生物反应器补液和细胞废弃的自动化。在Sartorius，我们可以将这些监视器放置在我们所有的一次性生物反应器和RM 生物反应器中，以实现整个种子扩增链和主生物反应器的完全自动化，”Erdenberger说。
另一个获得关注的 PAT 工具是拉曼光谱。以前，使用这项技术的主要困难是需要“训练”数学模型，即单个代谢物与复杂拉曼光谱的相关性。“为了解决这一挑战，Sartorius 最近推出了可扩展的拉曼探针接口，因此这些模型已经预设在15-mL ambr [Sartorius] 高通量微型生物反应器中。这使得从早期开发开始就可以深入了解过程并提高对过程的理解，”Erdenberger说。
同时，最新一代的深层过滤器也是上游生物工艺的一项强大创新，Pall业务开发执行总监 Peter Levison 强调说。“随着生物工艺的不断发展，SUT 为药物制造商提供了一种替代解决方案，以适应不断变化的药物模式。然而，这对澄清步骤提出了新的挑战，”Levison说。
Levison 解释说，在传统的不锈钢设施中，离心一直是一种广泛采用的澄清解决方案，但在可提供更高细胞密度的小型设施中，例如较新的SUT 装置，离心不再可行。“不仅实施成本高，需要大量资金和工艺投资，而且占地面积更大，不容易规模缩小。因此，虽然离心非常适合10,000-L 不锈钢生物反应器和其它大型设施，但对于目前许多制造商使用的基于2000-L 一次性生物反应器的设施来说，它并不是理想的解决方案，”Levison断言。
深层过滤器提供了离心分离的替代方案，但也有一些性能限制 - 传统上处理的细胞密度一般约为20 x 10^6 cells/mL。“随着细胞培养的进步和滴度的增加，细胞密度已经可常规性地提高到 >30 x 10^6 cells/mL的水平，这就是先进的深层过滤器提供下一代澄清的地方。高性能平台可以灵活地支持半连续到完全连续的生物工艺，允许用户在每单位生物反应器体积中处理更多的产品。
Univercells Technologies 技术官 Tania Pereira Chilima 指出，对于基因治疗产品，细胞培养和病毒生产的传统技术不适合商业规模的生产。“这不仅是由于产能限制，因为这些培养瓶仅与横向扩展方法兼容，会增加成本和资本支出，而且还由于这些技术的劳动力密集型性质以及对关键过程参数缺乏控制（例如，pH、溶氧）。这带来了一些与工艺可靠性和再现性相关的监管问题。此外，整个行业都缺乏熟练的劳动力，这意味着由于资源限制，劳动力密集型工艺并不可行。”
Merck KGaA生物工艺主管Darren Verlenden 表示：“工艺强化和单元操作连接方面的技术改进使生产能够更高效地运行，并在更少的时间和空间内产生更高的产量，从而减少了资本投资。在上游，我们已经看到，利用灌流技术可以提高成本效率、降低风险并增强生产的灵活性。50%至 60% 的公司已经在探索或实施了用于种子培养或生产生物反应器步骤的灌流技术，”他解释道。
下游进展
技术和设备的创新也有利于下游生物工艺。最近的创新，包括用于无标记细胞选择的声致（acoustophoresis，超声波）细胞分离和高精度微流体、在线细胞漂洗和快速基因递送，已经显著提高了生产力，Draper精准医疗和细胞生物工艺负责人 Jenna Balestrini 表示，这是一家位于马萨诸塞州剑桥的非营利工程公司。
例如，为了在临床血液样本上完成细胞分离，Draper开发了一种系统，该系统在与一系列患者材料和输入体积兼容的高性能微流体设备中执行声致分离操作。该系统无需离心。“该模块在不影响细胞健康的情况下持续快速地去除干扰细胞污染物。Balestrini 表示，与传统方法相比，声致分离工艺的处理更少，提高了细胞的端到端产量，并加速了向下游步骤的传递。
在基因治疗领域，Draper 开发了一种微流体转导模块，可以将病毒载体共定位在细胞周围，增加病毒与细胞的相互作用，使用通常所需一半量的病毒载体即可实现高转导效率。这允许进行更受控的病毒基因递送。Balestrini说，该系统可以使用各种载体源在 90 分钟内以标准效率水平进行转导。
最后，为了在无需病毒载体或激活步骤的情况下将各种有效载荷（例如核糖核蛋白、mRNA或 DNA）引入细胞，Draper 设计了一种实用的连续流电转模块和在线缓冲液置换器，其使用高精度微流体，来严格控制细胞对电信号的暴露，提高通量，减少手动操作，并允许进行在线漂洗步骤，Balestrini 解释说。
“在下游工艺的不同产品类别中都可以看到突破性的创新，”Medvedev补充道。“在mAb 生产中，连续纯化工艺（即层析法）的出现显著提高了工艺生产力、产量和关键材料（例如ProteinA 填料）的利用率。”
Chilima 进一步补充说，在基因治疗领域，使用替代介质（例如，整体柱或膜层析，而不是传统的基于微球的分离）已被证明可以提高动态结合载量(DBC)，并减少工艺时间，因为这些替代性介质可以在更高的流速条件下运行。“此外，使用具有先进分离模式的膜和整体柱层析系统，能够一致地提高分离空衣壳和完整衣壳的分辨率，这在基因治疗生产中至关重要，”Chilima说.
Stoll 说，下游工艺的创新与上游工艺创新产生了类似的影响，即连续生产的发展 - 特别是连续层析 - 可以提高工厂产量，同时降低成本，并进一步发展一次性设备和数字工具。
“改进的在硅（计算机）和体外建模工具与高通量筛选技术相结合，可以提高我们的能力并缩短时间，”Mohindra说。他认为的进一步下游工艺创新将是为临床生产引入端到端的一次性解决方案（例如，预装柱、一次性流路）以及开发新的高结合载量填料。
Erdenberger 进一步强调了新型填料的开发是一项特别有益的创新。“首先，对于捕获步骤，具有更高结合载量和优化的碱相容性的新型（Protein A）填料可以显著提高下游工艺生产率，降低商品成本并改善生物负荷控制，”Erdenberger 观察到。“目前，即使是‘封闭、无菌’层析的要求似乎也可以使用经伽马辐照的预装柱实现，从而进行连续、无/低生物负荷的层析操作。与此同时，多柱层析和模拟移动床层析等连续下游技术已经成熟，并越来越多地用于强化下游工艺，”Erdenberger补充道。
Erdenberger 表示，对于精纯步骤，混合模式填料、膜吸附以及相关设备的显著改进，现在，并且越来越多地，允许流穿精纯作为一种高效的操作模式。他进一步解释说，对于除病毒步骤，正在引入允许连续病毒灭活和病毒过滤的方法，并且连续方法甚至可用于切向流过滤。
“这些技术导致连续或半连续的产品流进入工艺中的下一个单元操作，并以更低的填料成本实现更高效的层析。工艺也更快。当与某些上游操作（例如灌流）连接时，下游工艺可以直接连接，以实现从上游到下游的连续过渡，”Erdenberger指出。
整合效率
上游和下游工艺的这些进步产生了不同的影响，但总体而言是有益的。在创建对更深思熟虑和细致入微的工艺的要求的同时，它们还允许上游和下游之间更紧密地整合。“尽管这些创新增加了生物工艺的复杂性，但它们有助于显著降低生产原料药和产品的总体成本、时间和风险。例如，在某些生物工艺中，在生产培养仍在运行的过程中开始培养物收获，与传统方法相比，可以更早地开始纯化。此外，在线分析和产品属性控制策略允许在批次期间检测和实时调整CPQA，从而实现更有效的、可重复生产原料药的方法，”Follstad评论道。
“生物反应器生产力和下游单元操作进步的持续改进和相互作用正在提高效率并简化生产，”Verlenden补充道。“对上游强化的初步反应包括用于下游消除瓶颈的单程切向流过滤（SPTFF）。在新设施中，实施连续捕获和流穿精纯可以消除工艺限制，同时通过将缓冲液需求降低多达47% 来提高设施的适应性，”Verlenden 说。
Verlenden 解释说，生物制造商正在向供应商寻求整合的解决方案，因为他们在全面考虑其工艺的同时，还在设想未来的规模放大，因此在未来五年内，连续生物制造将在更好地整合上游和下游操作方面发挥不可或缺的作用。“我们的客户预计，在五年内，他们 40-50% 的工艺将采用连续捕获和流穿精纯技术，而端到端的完全连续工艺的采用可能会是下一步，”他估计。
回到传统的批次工艺，Levison 指出，传统工艺本质上是一步一步断开的。在上游，通过先进的深层过滤进行更有效的澄清提供了一种灵活的解决方案。“用户可以采用连续原料流的半连续或完全连续工艺方法，这也会影响整合下游工艺的能力。
凭借整合下游的能力，制造商可以创建更高效的工艺流程，提高产品质量，节省时间和金钱，并最大限度地提高整体生产力和设施利用率，”Levison 说。
与此同时，细胞疗法生物制造前沿的另一个值得注意的发展是将复杂的多步骤工艺集成到一个封闭式、模块化、自动化的台式系统中，该系统可实现有效、安全的生物制造，且可用于在医院（护理点）或在一个中央制造设施中运行，Balestrini说。Balestrini 指出，目前用于制造细胞疗法的仪器和方法价格昂贵、使用耗时、难以规模放大，并且它们有效递送遗传物质的能力有限。“模块化系统正在成为行业黄金标准，”她说。
然而，尽管在生物工艺方面取得了这些进步，但仍需要更多的工作来确保上游和下游工艺的顺利整合，Medvedev插话道。他指出了目前用于抗体纯化的一次性下游工艺技术正在应对的难题 - 即上游工艺中滴度的增加。另一方面，在基因治疗中，膜、基球和整体柱层析系统的高性能使上游工艺能够交付的与下游操作能够纯化的出现不匹配的情况。
“这是因为当前的病毒载体纯化技术是从蛋白质行业改造而来的，这使得它们对于病毒载体应用来说非常“大”。相对于上游工艺中收获的产品而言，使用当前可用的填料获得的DBC 很高。这可能会导致制造商在中间体冷冻步骤中将不同批次的产品合并起来，这在产量损失、冷藏空间、批间可变性问题和整体工艺复杂性方面存在缺点，”Medvedev解释说。
原文：F. Mirasol,“Technology Advances Streamline Bioprocessing,” Pharmaceutical Technology 44(5) 2020.
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