细胞培养澄清收获的技术及经济考量：收获技术选择考量
本文节选自“Technical and economic considerations of cell culture harvest and clarification technologies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“细胞培养澄清收获的技术及经济考量：碟片式离心和一次性离心机”以及“细胞培养澄清收获的技术及经济考量：基于过滤的技术及其它策略”。
在过去的几十年中，生物制药生产的生物工艺在上游和下游工艺方面都取得了重大的技术进步。上游细胞培养工艺的强化导致了更高的细胞密度，使更小的生物反应器能够提供与更大、更低滴度系统相同或更高的产量。这些高强度培养增加了上游和下游工艺之间的工艺负担：特别是收获分离，增加的负担可能会改变给定收获技术的一些技术和经济效益以及缺点。考虑到这些变化，我们在这里回顾了主要收获技术的操作基础，并讨论了生物工艺工程师在为其强化工艺选择合适技术时可能考虑的潜在因素。本文将总结在上游强化背景下“老化”技术面临的具体挑战，以及实施新策略和新兴技术的前进道路。利用生物工艺经济学建模工具，我们研究了两种广为接受的技术的经济性：碟片式离心和一次性深层过滤，并讨论了生物工艺趋势将如何影响这些收获方法的经济性。考虑到生物工艺不断变化和多样化的格局，可能没有万能的解决方案，并且必须仔细权衡许多因素，才能选择合适的收获分离技术。
一般考量
选择生产技术可能是一个复杂的过程，高度取决于工艺开发限制、细胞密度、规模和工厂影响。表 1列出了可用收获方法的优点和缺点，下文将对各种方法进行更详细的描述。
表1. 主要收获技术的简单比较
方法 | 优势 | 劣势 |
深层过滤（DF） | 去除可溶性杂质 从PD到工业化规模，接近线性的规模放大 | 对于高细胞密度，较低的吞吐量 高耗材成本 高固体废物 |
微滤，包括切向流过滤和交替式切向流过滤 | 无颗粒滤液（降低二级澄清需求） 潜在的培养强化 | 对于高细胞密度，较低的吞吐量 较长的收获时间 潜在的细胞破碎 |
碟片式离心机（DSC） | 高吞吐量 可处理高细胞密度 低运营成本 | 实验室规模模型有限 需要二级澄清 需要CIP/SIP系统 潜在的细胞破碎 高资本投入 较慢的产品转化 |
一次性离心机 | 低剪切 无需CIP/SIP系统 快速的产品转化 | 低吞吐量 新兴技术 需要二级澄清 |
切向流深层过滤（TFDF） | 单个预组装装置 按键式高度自动化 | 新兴技术 需要二级澄清 产物稀释 |
工艺开发是一个设计过程，针对特定产品形成生产平台。这首先要优化实验室规模的生产工艺。实验室规模用作产品的初始概念验证。这通常在毫升体积的摇瓶中或在台式生物反应器中进行。在小试规模之后，该工艺被放大到中试规模。这通常在10 -1,000 L 之间的生物反应器体积中完成。中试规模用于提高模型的准确性，以放大到工业化规模的最终设计。在这些开发阶段，开发规模缩小模型可以简化并加快工艺开发。准确的模型可用于帮助预测工业规模的性能和最佳条件。但是，目前难以为碟片式离心机等操作开发具有代表性的规模缩小收获模型，而过滤操作的模型已得到了很好的建立。
图 2 中可以看到经常使用的不同收获技术的典型处理体积范围。碟片式离心机缺乏实验室规模的可用产品，限制了在生物反应器规模以下开发规模缩小模型的可行性，其通常需要几百升来匹配大规模（例如>2,000 L）的性能。因此，离心工艺开发通常在250 – 1,000 L 的中试规模下进行。这大大增加了工艺开发成本，因为每个收获数据点都需要更大的上游投资和相对较高成本的硬件安装。相反，深层过滤器可以作为一次性设备，且对于支架和泵等硬件的投资成本较低。深层过滤器和TFF 过滤器可提供针对最低工作体积的产品选择，可随时用于 1L 或更低的处理体积，允许建立从实验室规模到工业规模的精确模型，这大大降低了进行工艺开发研究所需的物料，并可实现更快速的处理能力测试，以实现更优化、更稳健的大规模工艺。这是典型的离心操作所没有的好处。
图2. 用于不同生物反应器体积的典型收获方法的比较。
图3. 生物反应器体积对收获工艺工厂运营占地的影响。实线代表工艺滴度为3 g/L，虚线代表工艺滴度为10 g/L。对于碟片式离心机，使用单台离心机，增加处理时间，以满足处理体积需求。碟片式离心机之后使用精细二级过滤器，其是所需占地增加的主要原因。
细胞培养强化导致活细胞密度和细胞生产力的提升，从而提高了单位体积产量。由于收获技术的处理能力限制，高细胞密度会使收获工艺复杂化。由于过滤器截留杂质的能力有限，深层过滤性能受到更高固体含量的挑战。使用足够的过滤面积时，过滤操作可以处理更大的体积或更高的固体含量。使用Biosolve Bioprocess Modeling Software，我们比较了碟片式离心机和深层过滤针对不同细胞培养体积所需的操作占地。如图 3所示，基于设备的操作占地，存在明显的限制。图 3证明了过滤器外壳数量的增加，因为斜率明显逐步增加。由于经常需要增加过滤器外壳的数量，深层过滤相对于增加的处理体积，具有更大、更频繁的占地面积增加。另一方面，与应对不同体积和滴度的两级深层过滤相比，碟片式离心机对细胞密度或体积增加不太敏感，并且对占地面积的影响很小。离心的操作占地增加是由二级深层过滤操作引起的。一次性离心机的占地也可以保持相对静态，类似于碟片式离心机，因为操作模式相似。然而，一次性离心机具有较低的有效流速，因此，一次性离心机相比碟片式离心机，可能存在一些占用空间、时间或性能权衡。比较独特的是，中空纤维微滤和TFDF被宣传为能够在整体占地面积上保持相当静态，这是由于过滤器的垂直、纤维重复并行结构以及总体占地面积更小的标准系统的存在。
在选择收获技术时，操作占地仅反映了要权衡的运营考量因素的一个方面。除了操作空间之外，其它运营考量因素可能还包括仓库物流、从存储到洁净室的运输、设备安装时间和设备自动化水平。例如，碟片式离心机几乎不需要任何耗材来存储、运输或安装，除了离心后的几个二级过滤器。一次性离心机需要存储的耗材相对较小，与传统的一次性深层过滤器相比，可在总体上节省仓储空间。深层过滤器，不管何种结构形式，都需要相对较大的存储空间，并且在带入洁净空间时，可能会带来安装和后勤方面的挑战。例如，对应2,000L 反应器的典型深层过滤操作可能需要30-60 个过滤器，每个过滤器都必须在使用前被带入洁净空间、打开包装、安装并用缓冲液冲洗。微滤和TFDF可以再次受益于它们的外形结构，而避免了对较大仓储空间的需求。
虽然这些收获技术中的许多选择需要两步收获，但微滤提供了一种独特的单步收获解决方案，能够将流出液直接送至层析步骤。通过将初级层析步骤与收获相结合，可以缓解更长收获时间和更低通量的权衡。通过以更连续的方式整合这些步骤并循环层析柱，初级层析柱和系统可以比典型收获操作所需的配置小得多。考虑到亲和层析柱可以贡献25%的下游工艺成本，收获后更小的柱子可以大大节省成本。
碟片式离心机需要在线清洗 (CIP) 和在线蒸汽灭菌 (SIP) 配套设施，以确保批次使用之间的清洁和无菌性。在多产品工厂中，由于设备的许多角落和缝隙会增加产品交叉污染的风险，因此在不同的产品处理之间准备碟片式离心机可能是一个需要大量拆卸、清洁、灭菌、验证和记录工作的过程。整个过程可能既昂贵又耗时。清洁碟片式离心机会延长批次之间的周转时间，并产生大量的水性化学废物。通过消除整个清洁过程，深层过滤、TFF、TFDF或一次性离心机等一次性操作相比碟片式离心机具有很大的优势。现在很多公司正在建设完整的一次性工厂，生物反应器体积更小，但产品转换更快。一次性技术还具有降低批次间交叉污染风险的好处。
可持续性
工艺中针对 CIP 和 SIP 的考虑提出了另一个需要考虑的指标，即可持续性。鉴于公司遏制浪费和减少用水量的压力越来越大，确定收获技术的可持续性可能是选择过程中不可或缺的一部分。在上游工艺过程中会产生两种主要类型的废物：1)清洁废物 - 通常是来自工艺和后处理清洁的水流，以及 2) 消耗性废物 - 通常是固体，例如在单元操作中使用的一次性容器、过滤器、管路等。废物在工艺过程中也可能被污染，这可能需要更复杂且可能成本更高的处置。
深层过滤等一次性工艺通常会比碟片式离心机等固定资产产生更多的固体废物，因为每次运行都会使用新的耗材。另一方面，碟片式离心机的操作、清洁和消毒会产生大量的废液，包括潜在的腐蚀性物质和生物危害性污染流。例如，在我们对 5,000L 批次的建模中，碟片式离心机的废液量估计为每批次 2,500L，而深层过滤产生的直接废液不到 300 L。然而，5,000 L处理规模的深层过滤估计会产生400 kg 固体废物，而碟片式离心机的工艺固体废物被建模为少于该数量的25%。与碟片式离心机和深层过滤相比，TFDF或一次性离心机等替代收获技术具有减少水和固体废物的潜力，并可能在这方面提供新的可持续性标准。
仅从原始质量或体积的角度比较废物流（例如水vs固体废物）会在一定程度上混淆问题。例如，废液的收集和处理方案是有效且普遍的。相比之下，固体废物通常会包含更多样化的材料，这些材料难以分离和处理（例如回收）。固体废物也已被证明比易于化学处理的废液水流更难净化。固体废物的主要选择是填埋、焚烧或回收，填埋是最普遍可用但最不可持续的选择。固体废物的回收会陷入固体废物不同性质的泥潭，使得这种回收操作需要消耗一定的能源，且在经济上产生不利的影响。将能量回收与改进的焚烧技术相结合，有望成为一种相对清洁的替代方案，但由于安装和维护所需的资金，对于许多潜在用户来说仍然昂贵且难以维持。可以肯定的是，仍有许多领域需要改进收获工艺技术的可持续性。
成本考量
药物生产过程中一个自然而然的关键因素是成本。从经济角度来看，每种技术都具有独特的优势，但很大程度上取决于制造商的目标。在无数其它因素中，操作规模、细胞密度、产品转换需求以及利用一次性技术的决定都可以在影响制造商的偏好方面发挥作用。为了分析这些各种因素的影响，我们使用了已建立的生物工艺经济学工具Biosolve Process，该工具在工业和文献中被广泛接受。具体来说，我们采用了Pleitt 等人描述的方法。我们利用 Biosolve 工具中提供的基准定价和性能参数，并包括了额外的专有定价、性能和市场信息，以提高模型预测的准确性，从而特异性地分析变量对收获工艺经济性的影响。
当放置在一个全面一次性使用的工厂中时，一次性技术通常不需要CIP/SIP 系统，因此减少了对任何清洁设备的额外资本支出的需求。如果没有CIP/SIP 系统，制造商就无需雇用额外的工程人员来操作和维护这些机器，从而在观察到的资本减少之外转化为额外的劳动力节省（见图 5）。如前所述，一次性技术可以降低污染风险，并为制造商提供更快的批次周转时间和产品转换。这些好处在财务上更难量化，但随着吞吐量的增加，很明显可以节省成本。由于一次性方法仅在特定体积和滴度下可行，因此一次性技术可能最适合特定的产品和生产需求（见图 4）。
图4. 每克成本趋势。对于不锈钢离心机和深层过滤，生物反应器体积和产物滴度对每克成本的影响。
深层过滤的资本成本要低得多，因此需要的前期投资比碟片式离心机少。对于使用深层过滤器的制造商来说，这意味着大部分成本是在生产过程中产生收入时产生的，这与碟片式离心机不同，后者的大部分成本是在建设阶段因大量资本支出而产生的（见图 5）。另一个关键的经济效益是深层过滤允许在低于特定水平的细胞密度范围内实现更快的周转时间。当需要更快的工艺时间时，并行运行过滤器链的灵活性使制造商能够更好地控制速度，从而转化为额外的节省和利润。如果制造商有足够的空间，深层过滤可能是一种非常简单的方法，可以优化周转时间，为市场生产更多产品。最终，深层过滤对于几乎所有制造商来说都是一个非常可行的选择。CMO、临床、甚至小型/大型商业化公司（假设空间不是限制因素）都可以在大多数工艺中使用深层过滤。
利用生物工艺模型，我们检查了两级深层过滤的每克成本，并与碟片式离心机加澄清过滤的方式进行了比较。在此研究中，假设由于潜在的细胞培养强化，当产物滴度从 3g/L 增加到 10 g/L 时，深层过滤器处理量降低三分之二。通常，更高滴度的工艺与更高密度的培养相关，但也并非总是如此。选择过滤器处理量的这种降低程度是为了考虑保守的性能情况。资本支出已折旧并包含在成本分析中。如图 4所示，在两种情况下，碟片式离心机是经济上的最佳选择。首先，如果制造商正在大批量生产（5,000L或以上）。其次，如果滴度和细胞密度非常高。虽然碟片式离心机所需的初始资本具有更高的固定成本，但随着体积的增加，运营成本会降低，这是一次性方法无法复制的。在大体积条件下碟片式离心机的受欢迎程度与该工艺的低可变成本有关。即使需要更多清洗，一旦制造商开始进行足够大规模的生产，碟片式离心机通常是最经济有效的。这意味着从碟片式离心机中受益最多的制造商是大中型商业化制造商。一些CMO 可能会从碟片式离心机中受益，但前提是CMO 的重点是大体积或高细胞密度培养。
图 5 显示了在5,000 L规模下，碟片式离心机和深层过滤的成本细分。碟片式离心机的资本支出很高，这对于小规模工艺来说可能是压倒性的，除非生产工厂已经有离心机。尽管低资本支出的深层过滤是较低体积和细胞密度的经济选择，但过滤器的耗材成本在较大体积时变得繁重。此外，深层过滤器链的安装和拆卸需要增加劳动力，这超过了离心机拆卸和清洗所涉及的劳动力成本。
图5. 5,000 L生物反应器、滴度为3 g/L时的成本细分。
总体而言，对于所有的生物工艺，没有唯一的最佳经济解决方案。相反，选择过程必须权衡工艺输入、收获技术的功能和整体工艺经济性，以选择合适的收获解决方案。
原文：W.A.Dryden, L.M.Larsen, D.W.Britt, et al., Technical and economic considerations of cell culture harvest and clarification technologies. Biochemical Engineering Journal, 167 (2021) 107892.
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