早期研究 & 临床前研究中的腺相关病毒载体工艺开发挑战
高产量 rAAV 载体的工艺开发专注于构建稳健且可重复的工艺，以满足生产设计考虑。通常，工艺开发涉及在开发的中-后期进行规模放大和规模扩展，以满足生产的质量、数量和监管方面的要求。但在发现和临床前阶段工作时，在早期阶段开始考虑工艺开发至关重要。
通常，pre-IND 研究包含多项临床前研究，包括安全性、有效性、生物分布评估。对于早期临床前研究，rAAV载体数量要求较低，因此通常我们需要设置多个、较小的rAAV 生产批次。但随着研究进展到多种动物和大型动物（非人灵长类动物），剂量要求更高，通常达到1×10^15 到 1×10^16 载体基因组范围。虽然仍处于研究阶段，但时间线和灵活性要求很高，我们不一定能针对各种GOI和rAAV血清型或异构体的组合而对每个目标载体进行工艺开发。
目前，文献报道了 100 多种 rAAV 血清型、杂交结构或异构体。每年我们都会看到关于发现新的rAAV 血清型或异构体的文献。每种 rAAV 类型可以根据衣壳成分、Rep、Cap与来自另一种血清型的互补 ITR 的组合而不同于其它类型。临床前研究通常从多种 rAAV 血清型开始，基于一些血清型在细胞趋向性、靶向相互作用和生物分布以及转导效率方面的密切相似性。每种rAAV 血清型在上游生产和下游纯化中都有其独特的优势、劣势和挑战。图 1显示了用于科研和临床前以及临床研究的最常用rAAV 血清型的例子。根据用于早期筛选的血清型数量，可以增加对早期生产和工艺开发的考虑。由于缺乏平台技术以及对不同rAAV 血清型的了解不足，rAAV 颗粒的生产平台通常复杂且具有挑战性。
图1. 通常用于临床前研究筛选和工艺开发的最广泛使用的AAV类型。
这篇综述文章将概述用于临床前研究的小规模和大规模rAAV生产的状态和挑战。值得注意的是，临床前研究通常集中在 rAAV 的功效和安全性上，并没有提供用于 rAAV 的生产和纯化方法的完整细节。rAAV 上游生产取决于所使用的细胞系、转染方法和质粒系统。上游细胞培养可用于贴壁和悬浮系统，而由于易于操作且建立工艺所需的时间短，许多研究都是从贴壁系统开始的。对于临床前研究，考虑到数量要求，贴壁系统可能是概念验证的良好开端。另一方面，悬浮系统可能需要更长的开发时间，但它可以真正从实验室规模放大到大规模搅拌罐生物反应器。悬浮系统便于收集上清液和细胞，并且有利于实现简单的在线样品收集以进行细胞培养分析。 目前，rAAV 生产常用的生产平台有 3种主要类型，如表 1 所示。每种平台都有其独特的优点和缺点，并且可以在载体质量、数量和可放大性方面提供不同的性能。
表1. rAAV常见上游生产平台的概况
生产平台 | 临床前考量 |
使用HEK293或相似细胞系的瞬时转染 | 转染复杂的可放大性以及高生产成本 |
杆状病毒感染/rHSV感染 | 需要前体杆状病毒或 rHSV ，可以增加额外的开发时间 |
稳定生产细胞系（PCL） | PCL额外的开发时间 & PCL细胞的稳定性 |
从长远来看，临床前应用中使用的上游生产平台和下游工艺的选择应该考虑临床和商业化，以便更容易地过渡。基于此，对工艺开发和大规模投资前的适当投入对于提前优化和验证工艺至关重要，以便确保监管合规性以及符合当前良好生产规范(cGMP)。
早期研究、临床前阶段中工艺开发的一些主要挑战
规模放大不是线性且简单的
在小规模条件下开发工艺并将其转移到大规模时，规模放大一个工艺的逻辑解释至关重要。但是基于病毒载体的工艺通常容易受到批次间差异性和可放大性差异的影响。在早期研究工艺开发中，针对每种rAAV 类型产品开发了单独的方法，从而创建了大量的方法组合。用于研究的小规模工艺利用不可放大的实验室工艺，例如用于细胞培养的贴壁培养瓶、用于澄清的离心、基于针头式过滤器的除菌过滤以及用于分离空和完整rAAV 颗粒的超速离心。大规模生产工艺通常看起来很不同，其利用更可放大的单元操作，包括通过深层过滤进行澄清、多个层析单元操作以及使用切向流过滤进行浓缩。图 2展示了小规模生产和纯化工艺与大规模工艺的比较。正如我们所看到的，不同规模的单元操作数量不同，这有助于平衡纯度与产量（单元操作数量越多，纯度越高，但rAAV 产量可能会降低）。
图2. 小规模和大规模生产中rAAV下游纯化概况和比较。
通常，在创建单独的方法时不考虑可放大性，例如，空衣壳的分离是使用基于氯化铯或碘克沙醇的繁琐密度超速离心方法进行的，制剂缓冲液置换是使用实验室规模的透析方法进行的。
表 2 概述了常见的下游单元操作和线性可放大性挑战。可以针对每个单元操作定义不同的线性可放大性，但是，没有任何可放大性挑战、并且易于将小规模研究转移和应用到大规模研究的工艺可以被视为线性可放大工艺。
表2. 常用于rAAV下游纯化工艺的单元操作以及线性可放大性
单元操作 | 线性可放大性 | 线性可放大性挑战 |
离心（初级澄清） | 否* | 由于处理体积的原因，可放大性受限，通常以批次模式进行 *有可用的连续离心设备 |
深层过滤澄清（初级和二级澄清） | 否 | 规模缩小模型与大规模模型不等效/不具有可比性 线性规模放大可能具有挑战性 |
切向流过滤（浓缩和洗滤） | 是* | 有规模缩小和规模放大模型可用，且可以线性放大 *基于 TFF 设备形式 |
透析（缓冲液置换） | 否 | 实验室规模透析不具可放大性 |
超速离心（分离空和完整rAAV） | 否 | 不连续的CsCl或碘克沙醇超速离心除小规模外，不具可放大性 |
层析（纯化） | 是 | 线性可放大性 由于缺乏每种规模的模型，对于更新的形式，如基于膜吸附、整体柱的层析柱，具有挑战性 |
因此，在早期研究中为 rAAV 临床前研究开发的下游工艺并不总是线性可放大的。科学家们经常以较小的体积进行优化，并认为在规模放大时它将成比例地线性化，但由于规模缩小和规模放大设备的差异，工艺通常不是线性可放大的。
临床前研究的质量 & 数量
在小鼠和非人灵长类动物 (NHP) 研究的体外、体内动物模型中，临床前研究的剂量要求在每项研究的总载体基因组 (VG) 方面差异很大。在设计临床前研究时，安全、无毒和生物学上合理的剂量水平是关键考虑因素。通常，对于体外小动物研究，我们需要少于1×10^10 到 1×10^11 总VG的rAAV（考虑到小动物和允许的微升剂量）。这种 rAAV 载体材料通常采用传统纯化方法以小规模（100 - 1000 ml）生产。而NHP 研究的剂量要求非常高，并且通常需要根据特定rAAV 类型的初始滴度进行大规模生产（>50 - 200L 规模）。
通常 NHP 研究包括多个 NHP，并且可能需要高于1×10^15 或 1×10^16 VG 的总载体要求。以与小规模相同的规格生产如此大量的 rAAV 通常是困难的。在这种情况下，许多研究小组需要将生产外包给 CDMO，这可能会引入相比之前临床前研究的多种差异性，从而增加可比性和研究结论的复杂性（图 3）。
图3. 早期体外、体内研究rAAV载体剂量和生产规模的比较。
大规模生产的纯化方法不同于小规模生产。因此，载体的质量和纯度随着小动物研究与NHP 的变化而显著变化，并可能影响研究比较。表 3列出了支持临床前测试的一些关键质量属性 (CQA) 和质量控制 (QC) 测试的例子。（注意：在临床前评估期间并不总是考虑放行检测或GMP 规范）。缺乏标准化表征（由于各种载体衣壳异构体的差异和相容性）也可能是控制多种血清型工艺开发的主要挑战。因此，在从小规模生产过渡到大规模生产规模和纯化方法时，质量控制和纯度比较至关重要。
表3. 由于操作规模的不同，表征中预期出现差异性的CQA 和 QC检测例子。
QC检测 | 检测/目的 | 小规模vs.大规模预期差异性 |
一致性：载体衣壳 | 衣壳ELISA：基于衣壳特异性ELISA的总载体拷贝数 | |
一致性：载体基因组 | PCR：含有基因组的颗粒/基于测序 | |
纯度：聚集 | SEC/DLS：体积排阻层析或光散射，以鉴定颗粒粒径分布和聚集 | X |
纯度：残留DNA/宿主细胞蛋白质/核酸酶/其它杂质 | ELISA/PCR | X |
纯度：空衣壳 | AUC/CryoTEM：分析型超速离心或透射电镜，以确定空和完整rAAV百分比 | X |
效力：VG浓度 | PCR（qPCR/ddPCR） | |
效力：感染性/表达活性 | 体外效力分析 | X |
安全性：标准（无菌性/支原体、生物负荷等） | 标准21CFR安全性检测 |
虽然 FDA 通常要求在临床生产中考虑 CQA，但建议在临床前研究期间尽早开始为整个工艺定义CQA，以避免在我们从小规模过渡到大规模时改变特性。在定义CQA 的早期投入时间和资源有助于更快、更顺利地过渡到后期阶段和商业化。
以下是查找到的与CMC、基因治疗产品分析开发相关的监管指南文件的非详尽示例。
FDA:https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/biologics-guidances/cellular-gene-therapy-guidances
结合人类基因组编辑的人类基因治疗产品3/2022
用于人类基因治疗研究性新药申请 (IND) 的化学、制造和控制 (CMC) 信息；行业指南1/2020
基于病毒或细菌的基因治疗和溶瘤产品的脱落研究的设计和分析；行业指南8/2015
细胞和基因治疗产品早期临床试验设计的考虑；行业指南6/2015
行业指南：研究性细胞和基因治疗产品的临床前评估
EMA: https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory/research-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy
临床试验中研究性先进治疗药物的质量、非临床和临床要求指南
基因治疗药物产品的质量、临床前和临床方面
含有转基因细胞的医药产品的质量、非临床和临床方面
基因治疗药物首次临床使用前需进行的非临床研究
基因转移载体无意种系传递的非临床测试
关于与重组腺相关病毒载体开发相关的质量、临床前和临床问题的反思论文
使用规模缩小模型进行概念验证和研究级生产
设计任何生产工艺的规模放大和规模缩小模型对于工艺开发至关重要。在使用多个目标rAAV 血清型和 GOI 时，通常需要规模缩小模型来进行初始概念验证，其可以在体积较小和载体浓度较低的情况下使用。但是，当我们需要为几种不同的构建体生产少量临床前研究级材料时，就会出现真正的挑战。规模缩小模型通常太小而无法生产和纯化足够的病毒载体，而常规大小和规模放大模型可能又太大。使用填料预装的96孔板形式进行规模缩小建模的层析工具来说相对容易获得。此外，还可以选择以小规模装填定制尺寸的层析柱。而深层过滤、切向流过滤、除菌过滤等过滤操作由于缺乏一次性使用的规模缩小模型而更具挑战性。最小规格过滤器和下一个可用尺寸过滤器之间的产品差距是研究级生产的挑战。在处理多种rAAV 血清型时，下游纯化会面临一些挑战，包括：
不存在覆盖广泛 rAAV 类型的规模缩小模型或选择有限，因此每个纯化步骤必须针对特定的 rAAV 衣壳异构体进行定制
rAAV 滴度和杂质水平的批次间差异性可能导致规模缩小模型的过载或欠载，并对放大提出挑战
每种 rAAV 类型包装效率的变化会改变空衣壳和完整 rAAV 颗粒的生产；因此，随着空衣壳与完整 rAAV 颗粒比例的变化，并非每次都适用相同的分离纯化工艺。
因此，同等考虑开发用于概念验证研究和小规模生物工艺的可放大和微型模型对于更快的临床前研究和顺利过渡到临床阶段至关重要。
资源
虽然我们在细胞和基因治疗领域看到了令人印象深刻的投资和增长，但从事病毒载体生产和工艺开发的熟练且经验丰富的人员严重短缺。这是一个在多个论坛上提出的关键话题，我们需要共同努力培养和培训更多熟练的科学家，以便在竞争激烈的CGT 环境中茁壮成长。
在小分子和生物药领域，生产是众所周知的“商品”，高技能人才很容易获得。我们经常不得不从小分子和生物药行业招聘新人才，并提供操作和处理病毒载体所需的基本培训。英国细胞和基因治疗弹射器（CGTC）最近的一份调查报告显示，在 CGT 领域聘用的候选人中，约有 63% 没有CGT 相关经验（31% 来自应届毕业生/研究生，23%来自 CGT 行业以外，9 %为新手）。
在为研究规模的工艺开发寻找和分配资源时，我们看到的最大挑战是我们是需要寻求“通才”或“专家”。通常需要一个跨职能的“多面手”科学家小组（例如：载体设计、上游工艺、下游工艺和分析）来满足不断生产研究级载体的需求。同时，需要不断改进工艺，这可能需要专家进行工艺优化。批次规模通常很小，以至于有时聘请能够操作生产、在某一特定方面具有高度专业技能的科学家是没有意义的。
虽然专家对工艺开发至关重要，但在研究规模的工艺开发中，能够处理端到端工艺中各个方面的通才可能更有价值。因此，非常需要对专门关注临床前生产实验室的科学家进行跨职能培训。
总结
本文强调了生产和纯化多种 rAAV 血清型以及不同目的基因的主要挑战和限制。考虑到使用 rAAV 作为新模式的基因治疗的增长以及仍处于早期阶段，我们必须努力建立稳健、可放大的生产技术，以帮助满足未来不断增长的需求。对平台技术的早期投资和早期工艺开发至关重要，它们可以帮助顺利过渡到后期临床试验并最终成功实现商业化。
本文节选、翻译自以下文章，由于水平有限，详细内容，请参考原文。文章旨在知识分享，如有任何问题，请联系处理。
原文：A.Saksule, Adeno-associated viral vector process development challenges in early research& pre clinical study. Cell & Gene Therapy Insights 2022; 8(3), 411–420.
相关阅读：