易生信-扩增子教程02-真菌引物选择
距离上次《生信宝典》联合《宏基因组》组织的扩增子分析线下培训结束己经有三个多月了。为方便广大读者的学习，现在开始陆续分享上次培训的内部资料——理论课程课件。希望对想自学分析的朋友起到一定帮助作用。
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首先讲一下真菌的定义，真菌通常指的是真菌界的生物，是一类单细胞或多细胞异养真核微生物,无光合色素，细胞壁含几丁质和纤维素。按功能划分，可大致分为3类，病原菌、共生菌和腐生菌。真菌具有很高的物种多样性，据估计全球大约150万种，仅次于昆虫，但是目前通过形态鉴定的物种只占 5-10%。因此，我们必须借助与分子生物学手段去研究真菌。那么就涉及到PCR扩增，而PCR扩增最重要的就是引物的选择。
从这张图上我们可以看出，随着分子生物学的发展，科学家们已经设计出了各种各样的扩增真菌的引物，主要涉及小亚基、大亚基和ITS区。那么这些引物到底有什么区别？我们应该如何来选择合适的引物呢？几十年来，科学家一致致力于解决这个问题，一直希望找到一对只对真菌专一，而又不能扩增出其他类生物的引物。
前人为此做了很多相关的研究，结果发现：与细菌的小亚基不同，ITS区对真菌物种的区分度最高，从这张图上我们也可以看出，对于同一个样品，ITS区能鉴定出的物种要明显高于小亚基和大亚基，并且its2区要高于its1区。
在2011年荷兰阿姆斯特丹举行的第四届国际条形码大会上，全球真菌学家一致同意确定将ITS作为区分真菌的条形码，
并于2012年发表在PNAS上，ITS对区分所有真菌有72%的成功率。
扩增子分析可以方便快速的解决我们许多的科学问题，但是我们也不能忽视他的缺陷，例如引物的偏好性问题，往往导致导致数据与实际环境中不同。从此图中我们可以看出，无论是ITS区还是小亚基大亚基区引物，采用扩增子分析时，与采用宏基因组方法分析的结果都存在差异。所以选择合适的引物进行扩增，对科研的开展尤为重要！尽管我们不能百分百的解决此问题，但是我们还是要尽量提高鉴定的精度
Tedersoo2016年总结了前人的文献之后，给出一些可供选择的扩增真菌的引物。但是这些引物也不是尽善尽美，有些引物对真核生物专一，可能导致扩增出许多非真菌的序列，影响测序的序列数量。有些对真菌专一，又可能导致一些重要类群的丢失。
这是我们实验室经过多年摸索确定的我们认为比较好的引物，我们之所以采用两轮PCR是因为，土壤提取的DNA太复杂，往往含有大量杂质，如果采用一轮的话，经常扩增不成功。最开始的时候，我们也是采用的ITS一区扩增，但是后来发现ITS2区的区分能力要好于1区，目前主要还是扩增2区。一轮引物可扩增its全长，二轮为针对特定区域的引物。后边两项为我们常用的反应条件和体系，需要提醒的一点是，大家还是需要做预实验。
然后再给大家介绍两对最新设计的引物，第一个为Talor 16年发表在AEM上的，为5.8S-Fun～ITS4-Fun,目标区段为ITS2区
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