从mRNA药物分子设计到免疫反应------聊一聊基于mRNA的癌症疫苗（下篇）

Original 向阳屯铁匠细胞与基因治疗领域 2022-06-21

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在2020年之前，提到疫苗大家可能只会想到灭活疫苗、病毒载体疫苗，而在COVID-19肆虐全球之后，相信所有人都了解到了一个疫苗新品种----mRNA疫苗。在2020年，Moderna与BioNTech以史无前例的速度推动了两款新冠疫苗的研发与上市，让上亿的人群免受COVID-19的重症侵害。同样的，mRNA疫苗技术也为治愈癌症提供了新的武器，本系列文章小编就带大家从药物分子设计到免疫反应等方面聊一聊基于mRNA的癌症疫苗，本次（下篇）小编主要为大家介绍基于mRNA的癌症疫苗，包括编码肿瘤相关抗原的直接注射mRNA疫苗、编码肿瘤新抗原的直接注射mRNA疫苗和基于mRNA的DC疫苗。

一、mRNA药物分子设计

（详见往期文章：从mRNA药物分子设计到免疫反应------聊一聊基于mRNA的癌症疫苗（上篇））

二、mRNA疫苗在体内的免疫学作用

（详见往期文章：从mRNA药物分子设计到免疫反应------聊一聊基于mRNA的癌症疫苗（中篇））

三、基于mRNA的癌症疫苗

目前癌症疫苗主要有四种类型，包括基于肿瘤或免疫细胞的疫苗（注：基于肿瘤细胞的疫苗是指将经过修饰的死亡肿瘤细胞/注射到患者的体内，再经由DC处理肿瘤细胞表面抗原并呈递给称为 T 细胞。这些T细胞活化后可以靶向疫苗细胞系呈递的抗原，进而破坏体内表达了这些表面抗原的活的癌细胞。）、基于肽的疫苗、基于病毒载体的疫苗和基于核酸的疫苗。基于核酸（DNA 或 RNA）的疫苗是一种很有前途的疫苗平台。① 首先，核酸疫苗允许同时递送多种抗原，涵盖各种肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigens ，TAA ）和肿瘤特异性抗原（Tumor-Specific Antigens，TSA）引发体液和细胞介导的免疫反应，增加克服疫苗耐药性的可能性（注：TSA是仅在癌细胞上发现的肿瘤特异性抗原，不在健康细胞上表达；TAA在肿瘤细胞上高水平表达，但在健康细胞上又有一定水平的表达）。②其次，与肽疫苗不同，核酸疫苗可以编码全长的肿瘤抗原，允许 APC 进行同时呈递或交叉呈递，有可能刺激更广泛的 T 细胞反应。③ 最终，核酸疫苗是非传染性的，在生产过程中没有蛋白质或病毒衍生的污染，因此被认为在预防和治疗应用中都具有良好的耐受性。另外作为癌症疫苗策略，mRNA 优于 DNA 的优势包括：①mRNA 可以在分裂和非分裂细胞中翻译，其中 RNA 只需内化到细胞质中，然后一步翻译成抗原，并且mRNA 蛋白表达的速率和表达量通常高于 DNA 疫苗；②与DNA疫苗不同，mRNA疫苗不能整合到基因组序列中，因此没有引起插入诱变的风险。

到目前为止，已有超过 20 种基于 mRNA 的免疫疗法进入临床试验，并在实体瘤的治疗中取得了一些有意义的结果。其中，将 mRNA 转染到 DC 后，再把该DC细胞进行过继性细胞输注 (Adoptive cell transfer)回患者体内的方法，是第一个进入临床试验的基于 mRNA 的治疗性癌症疫苗所采用的策略，并且在临床试验中，基于 DC 的 mRNA 疫苗治疗仍然占 mRNA 癌症疫苗的大多数。但与此同时，CureVac、BioNTech 和 Moderna等公司也在积极探索由非病毒载体提供的基于 IVT mRNA 的免疫疗法。例如有的研究是利用mRNA编码TAA的混合物或者个性化的肿瘤新抗原，也有的研究利用mRNA编码免疫刺激剂（例如 IL-12、IL32、OX40L、CD40L、CD70 等），通过瘤内或结内注射来改变肿瘤微环境。随着癌症免疫疗法的最新进展，特别是新抗原的发现、个性化疫苗和检查点阻断调节剂的开发， mRNA 疫苗对抗癌症的有了越来越强的可行性。

肿瘤的治疗性疫苗

1. 编码肿瘤相关抗原的直接注射mRNA疫苗

开发有效癌症疫苗的主要障碍之一，就是抗原选择困难。癌症疫苗可以以在肿瘤细胞中优先表达的 TAA为靶向（例如，酪氨酸酶、gp100、MAGE-A3、MAGE-C2 已被确定为黑色素瘤的 TAA）。在多项临床研究中，编码TAA 的 mRNA 疫苗混合物已用于治疗转移性黑色素瘤。

在早期的研究中，科研人员会直接注射无包裹的裸mRNA到体内。有研究显示，经皮内或淋巴结内给药的裸mRNA可以在小鼠或人体中引发T细胞反应。结内注射的基本原理是将疫苗直接输送到 T 细胞启动区域，以供常驻 DC 吸收。未成熟的 DC 在淋巴结和真皮中对裸露 mRNA进行摄取的主要机制是巨胞饮作用。mRNA在DC细胞内表达TAA，再由MHC呈递给T细胞。裸 mRNA 疫苗的可行性和安全性首先在 15 名转移性黑色素瘤患者的 I/II 期试验中得到证实，该试验使用皮内注射自体肿瘤 mRNA 和 GM-CSF（注：① 该mRNA所编码的肿瘤相关抗原包括粘蛋白 1 (MUC1)、癌胚 (CEA)、人表皮生长因子受体 2 (Her-2/neu)、端粒酶、存活素、和黑色素瘤相关抗原 1(MAGE-A1)；② 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF，又名集落刺激因子2 colony-stimulating factor 2，CSF2，是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的一种单体糖蛋白细胞因子。GM-CSF可促进DC细胞及巨噬细胞等抗原呈递细胞的增殖与分化，可以有效诱导多种具有抑瘤效应的免疫细胞增殖，从而发挥抗肿瘤免疫反应。GM-CSF治疗在肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、黑色素瘤及恶性血液病中具有显著的抗肿瘤和免疫调节作用。虽然GM-CSF可以有效提高患者体内抗原呈递细胞的活性与增殖水平，但是激活机体自身抗肿瘤免疫反应仍需要体内有大量肿瘤抗原释放才能被抗原呈递细胞识别并结合，从而呈递给T细胞）。疫苗接种具有良好的耐受性，没有严重的副作用和诱导临床反应。几乎所有具有临床反应或疾病稳定的受试患者都检测到了免疫反应，患者接种疫苗后引发的 T 细胞反应在治疗期间可以持续数月，并且这种方法可以产生针对多种抗原的多克隆免疫反应。但在这项试验中，临床有效性并不明显。

肿瘤的TSA与TAA

局部给药的一个主要限制是只有经过注射给药的淋巴结才能进参与抗原特异性 T 细胞启动。静脉内mRNA给药则需要一些载体制剂将 mRNA 递送至全身二级淋巴器官，其中包括作为免疫细胞最大聚集体的脾脏。静脉给药时所选用载体需要可以保护 RNA 的完整性，还需要可以促进RNA在淋巴结驻留 DC 中的靶向表达。通常的载体制剂包含聚合物，如鱼精蛋白，或纳米脂质体等等。例如已经开展临床试验的BioNTech的BNT111，它是使用lipoplex脂质体纳米颗粒包裹着编码了四种黑色素瘤抗原（分别是NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和 TPTE）的mRNA，再用静脉注射的方式给到患者体内。该脂质体纳米颗粒的特性可以将mRNA 有效地递送到脾脏的 DC中，并导致 NK 、 B、CD4 +、CD8 + T 细胞的强烈激活。在目前的临床试验中，BNT111单独或与检查点抑制剂 PD1 的阻断联合使用，治疗接受检查点抑制剂 (CPI) 治疗的不可切除黑色素瘤患者。目前已经在受试者体内观察到高强度的、针对疫苗抗原的CD4 +和 CD8 +的T 细胞免疫反应。一些受试者的抗原特异性细胞毒性 T 细胞反应的量级甚至与过继性 T 细胞治疗的常见量级相当，并且时间持久。

BioNTech 与 Moderna的癌症疫苗研究管线

2. 编码肿瘤新抗原的直接注射mRNA疫苗

就目前来说，有些障碍限制了 TAA 疫苗的进一步应用，这其中包括：①对于某些实体瘤，仅鉴定出有限的 TAA，导致其应用受到了限制；②患者的 TAA 具有广泛的变异性，导致可以逃避免疫效应物的识别；③TAA也存在于正常组织中，因此针对 TAA 的疫苗可能会引发中枢和外周耐受反应，从而降低疫苗接种效率或者产生针对正常组织的自身免疫。肿瘤特异性抗原，也被称为新抗原，它们来源于肿瘤细胞中的随机体细胞突变，因此而不存在于正常细胞中。与那些未突变的自身TAA抗原相比，新抗原可以被宿主免疫系统识别为“非自身”的motif，因此是目前癌症疫苗的一个有吸引力的靶标。

很多实验已经证实，新抗原具有免疫原性，可以导致 T 细胞反应。并且许多临床前和临床研究表明，新抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 是最有效的肿瘤排斥 T 细胞之一。然而，患者体内天然存在的新抗原特异性 CTL 的情况却通常很少见，这可能是由于新抗原在肿瘤细胞群体中克隆频率低和新抗原的提成效率较低造成的。因此，通过癌症疫苗来增强机体针对新抗原的有效免疫，进而利用免疫系统来杀伤肿瘤细胞是可行的。

编码肿瘤新抗原mRNA疫苗是一种真正的个性化疫苗，因为大多数新抗原来源于每个肿瘤基因组中的独特突变。因此，识别患者特异性的具有免疫原性的新抗原是开发此类个性化疫苗的第一步。随着基因组测序技术以及 MHC 表位数据库和预测算法的进步，现在可以识别和筛选个体患者的癌症新抗原。通常，会先对患者肿瘤或肿瘤相关样本进行全外显子组或转录组测序，进而通过比较肿瘤和健康组织的序列来识别肿瘤癌细胞中的非同义体细胞突变，例如点突变和插入缺失。接下来，再使用 MHC 肽结合亲和力的预测算法，对所发现的突变进行筛选，以确定可以用于制造个性化癌症疫苗的最具免疫原性的抗原（这个筛选要考虑蛋白酶体对该肽的加工、与MHC的亲和力等等，目前的算法多是针对于识别 MHC I 类分子，针对于MHC II类分子的算法则少得多）。

基于MHC I 类分子的抗原提呈预测工具

目前有多项研究编码新抗原的 mRNA 疫苗的安全性和有效性的临床试验正在进行中。例如Moderna开发的 mRNA-5671，它是用脂质纳米颗粒 (LNP) 包裹的mRNA 癌症疫苗，编码了四种最常见的 KRAS 突变（G12D、G12V、G13D 和 G12C）的多肽序列，具有潜在的免疫刺激和抗肿瘤活性。在接种疫苗后，mRNA 生成的 KRAS 靶向肽被抗原呈递细胞 (APC) 吸收和翻译。翻译后，抗原通过 APC 表面上的主要组织相容性复合体 (MHC) 分子呈现给免疫系统。这导致细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 和记忆 T 细胞依赖性免疫反应的诱导，这些免疫反应特异性靶向和破坏具有这些特定 KRAS 突变的肿瘤细胞。

新抗原发现、疫苗制造和配制以及患者接种疫苗过程

3. 基于mRNA的DC疫苗

DC是专业的抗原呈递细胞，它会不断吞噬周围环境中的细胞物质再将其处理后传递给免疫系统。为了有效地将肿瘤抗原递送至 DC，许多早期研究致力于对离体的 DC进行改造或抗原转染，再通过皮下、结内或静脉注射将转染细胞重新输注给患者。DC 疫苗的生产需要从自血液中分离单核细胞或造血祖细胞开始，再经由离体培养、分化和肿瘤抗原加载等步骤完成DC疫苗制备，成本高且工艺复杂。目前常见的策略包括：①使用确定的 TAA/TSA等的 mRNA来转染DC ，但似乎被转染了mRNA 的 DC 疫苗诱导的 T 细胞反应比较微弱，这可能是抗原负载影响了DC 分化、成熟、归巢和 T 细胞共刺激以至于有的临床疗效较低；②工程优化DC 的抗原呈递。同源的辅助T细胞的协助，是决定疫苗激活CLT细胞反应的关键因素（因此需要强化DC的抗原交叉呈递能力），这就需要DC也能够把疫苗抗原呈递在MHC II 类分子上。转染到 DC 中的 mRNA 在细胞质内进行翻译，翻译后的蛋白会进入内源性抗原加工区-蛋白酶体中，进而呈现在 MHC I 类而不是 MHC II 类分子上（虽然DC也可以进行交叉呈递）。目前有几种方法能够促进在DC上的交叉呈递，例如可以将mRNA编码的抗原靶向到溶酶体区室，从而增强 MHC II 类分子介导的抗原呈递（将疫苗抗原与溶酶体相关膜蛋白相融合，或与MHC I 类分子的跨膜结构域相融合等等）；③在DC内表达共刺激配体或共刺激细胞因子等，正如前文提到的，为了激活T细胞反应，除了抗原识别信号外（相当于TCR 与肽-MHC 复合物的结合），还需要有共刺激信号，以及随后连续产生的细胞因子来辅助。因此这个策略旨在通过将抗原与免疫刺激配体、共刺激细胞因子一同表达，以增强 DC 成熟和 T 细胞共刺激，从而进一步提高载有肿瘤抗原的 DC 疫苗的 T 细胞启动能力。

基于mRNA的DC疫苗

总之，mRNA 是一个功能强大且用途广泛的癌症疫苗平台。小编的这个文章也只是把几篇重要的综述简单化，然后把最入门的内容翻过来推给大家。那小编也把所有的参考文献放在了附录中，以供大家对感兴趣的内容进行深究。

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参考资料：

https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-021-01335-5

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.01499/full#B13

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3345975/

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26343191/

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.4161/onci.20926?scroll=top&needAccess=true

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4570143/

https://blog.crownbio.com/targeting-tumor-associated-antigens-and-tumor-specific-antigens

https://www.futuremedicine.com/doi/full/10.2217/nnm-2016-0275