拜耳子公司被批准开展亨廷顿基因治疗临床试验

Asklepios BioPharma (AskBio) 是拜耳全资子公司，该公司已获得法国监管机构的批准为亨廷顿病的基因治疗（BV-101基因疗法）开展临床试验。

I/II 期研究将于今年年底前开始， BV-101基因疗法使用腺相关病毒 (AAV) 载体直接递送目的基因至亨廷顿病患者的大脑内，通过过表达CYP46A1达到治疗疾病的目的，CYP46A1是一种酶，这种酶在患有与胆固醇代谢有关的疾病的人的大脑中减少，并且似乎在神经退行性疾病的发病机制和进展中起关键作用。在临床前的动物试验研究中，该疗法已被证明具有神经保护作用，可修复有缺陷的胆固醇代谢途径，并恢复身体机能。这与 uniQure 公司的基于 AAV 的基因疗法 AMT-130 采取的方法不同，该疗法旨在沉默亨廷顿 (Htt) 基因，该基因在发生突变时会产生一种被认为对神经元有损伤的缺陷蛋白。

6 月份，uniQure 报告了支持其安全性的 AMT-130 的 12 个月数据，但尚未报告任何疗效数据。“与其他治疗亨廷顿病的尝试不同，BV-101旨在恢复胆固醇代谢，减少突变亨廷顿蛋白并改善神经元功能，” AskBio公司的神经生物学副总裁 Nathalie Cartier-Lacave 说。“重要的是，BV-101 不会影响细胞中正常亨廷顿蛋白的表达水平。”她补充道。

I/II 期试验是一项开放标签、剂量递增的临床研究，将在 12 至 18 名受试者中测试不同剂量的BV-101。临床试验将由法国罕见病神经遗传学参考中心的遗传学教授 Alexandra Durr 领导。

2020年，AskBio收购了BrainVectis，丰富了其亨廷顿舞蹈症和其他退行性疾病的治疗研发管线。同年，AskBio加入了拜耳公司，成为拜耳推进细胞和基因疗法在内的新治疗平台的重要基石。

一． AskBio的基因治疗研发管线

目前，AskBio在神经肌肉、中枢神经系统、心血管、代谢等疾病的方向上，有6项在研药物。其中治疗庞贝病 Pompe disease、帕金森氏症Parkinson’s disease与充血性心力衰竭Congestive heart failure的药物已经进入一/二期临床，治疗肢带型肌营养不良LGMD (2i/R9)、亨廷顿氏病Huntington’s disease与多系统萎缩Multiple system atrophy的药物也已经进入到临床前阶段。其治疗血友病药物（武田于 2014 年收购的 Chatham Therapeutics）和 Duchenne 肌营养不良症药物（辉瑞公司于 2016 年收购的 Bamboo Therapeutics）已经签署了licensed-out的许可协议。2015 年，AskBio 授予 AveXis 非独占性的全球许可，允许在 Zolgensma ® 中使用其开发的自我互补 DNA 技术（scAAV）治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）。

1. 庞贝病治疗药物ACTUS-101：

庞贝病（糖原贮积病 II 型；酸性麦芽糖酶缺乏症）是一种由横纹肌和平滑肌中的酸性 α-葡萄糖苷酶 (GAA) 缺乏引起的破坏性肌病。它会引起糖原在溶酶体内沉积，导致溶酶体增生、破坏，甚至释放不正常的溶酶体酶而致一系列的血细胞遭到破坏。庞贝病主要影响肝脏、心脏和肌肉，并会导致肌肉无力和呼吸困难。尽管可以使用重组人 (rh) GAA 进行酶替代疗法 (ERT)，但是许多患者的预后很差。这主要是由于(rh) GAA的半衰期短，以及病人体内显著的抗 GAA 的抗体反应所造成的。ERT 的局限性促进了庞贝病基因疗法的临床前开发。ACTUS-101通过单次静脉注射稳定转导肝脏组织，并在肝脏中特异性持续表达 GAA。GAA通过受体介导被细胞摄取，从而纠正了 GAA 的缺乏并清除了心脏和骨骼肌中积累的大部分的糖原。与ERT 的周期性、高水平GAA暴露不同，基因治疗会使骨骼肌持续、低水平地暴露于来自肝脏的 GAA，这可以预防或抑制由ERT 治疗后，抗 GAA 抗体形成所引起的并发症。与肌肉靶向的庞贝病基因治疗相比，肝长效疗法具有一定的优势，因为 AAV 载体对肝脏具有非常高的趋向性，这降低了庞贝病基因治疗对AAV剂量的要求。ACTUS-101使用了AAV8的衣壳，并用肝特异性启动子LSP来驱动GAA在肝脏内的表达。目前阶段的临床试验，主要是评估 ACT-101 治疗的安全性，以及评估这种治疗对患者健康的影响，包括运动能力（6 分钟步行）、肺功能的变化等等。

2. 帕金森病治疗药物AAV2-GDNF：

帕金森病是一种神经性退行性疾病，是常见的神经系统病变之一。在帕金森病人中，大脑的黑质区出现急剧功能退化，神经元细胞死亡从而无法向相关脑区分泌多巴胺，从而最终导致病人运动迟缓、静止性震颤、僵硬和姿势不稳定。GDNF 是一种天然存在于大脑中的神经营养因子，它被发现能为可分泌多巴胺的神经元细胞的生长和存活提供支持。随后的研究表明，GDNF 蛋白注射和GDNF基因治疗能够限制包括啮齿动物和非人类灵长类动物等多种帕金森动物模型的神经元功能障碍和退化。然而，神经网络在人类神经退行性疾病（例如帕金森病）中有长期的营养需求，因此需要持续供应或频繁施用营养因子。GDNF基因治疗可以在一次性给药后持续产生和释放 GDNF 蛋白，从而长期缓解病人的症状。AskBio的AAV2-GDNF是利用野生型的AAV2衣壳包裹AAV基因组，ITR内的GDNF会在CMV启动子的驱动下进行表达。AAV2-GDNF的大脑递送是在术中 MRI 引导下使用定制的神经外科方法和技术进行的。手术期间脑部 MRI 将AAV2-GDNF 的分布实时可视化，并允许根据每个人的精确解剖要求定制治疗剂的递送方案。

3. 充血性心力衰竭治疗药物NAN-101：

充血性心力衰竭 (CHF) 是一种慢性疾病，病人的心脏无法为身体提供足够的血液和氧气。这个病症可能是由心肌弱化、心肌僵硬或体内组织对氧气的需求增加，进而超出心脏供应能力的情况所引起的。充血性心力衰竭目前没有可以治愈的方法，药物和手术治疗只能缓解症状并减缓进一步的损害。研究表明蛋白磷酸酶抑制剂 1 (I-1c) 在衰竭的心脏中被下调，而使用基因疗法表达具有活性的I-1c ，则有可能会改善心脏功能并为治疗 CHF 带来新希望。目前NAN-101已经进入临床实验阶段，它是使用AAV 衣壳BNP116（AAV2i8）包裹着双链的AAV基因组，并使用CMV启动子驱动I1c基因的表达。

4. 多系统萎缩治疗药物AAV2-GDNF：

多系统萎缩 (MSA) 是一种罕见的神经退行性疾病，在美国影响多达 17,000 人。目前尚未发现特定遗传缺陷会直接导致这种疾病，因此它的发病原因很可能是遗传因素和环境因素的共同作用。该疾病的临床特征通常出现在 55 至 60 岁之间，60% 的患者在 6 到 10 年内从被确诊进展到死亡。该疾病的典型病症包括血压异常、尿失禁、帕金森综合征、平衡不良、睡眠功能障碍、手臂和腿部不协调以及痉挛。MSA 的两个主要亚型会表现出明显的帕金森病 (MSA-P) ，或会出现小脑 (MSA-C) 萎缩症状，前者占所有病人总数的 60%。最近，科学家在MSA病人的大脑壳核区域中发现 ，GDNF 和多巴胺的水平都有明显降低，该区域在帕金森病中也显示出明显的多巴胺耗竭。 GDNF 基因疗法旨在通过提高神经胶质细胞系衍生神经营养因子 (GDNF) 的表达水平，促进易受伤害的脑细胞的存活和功能缓解病人MSA 的症状。AskBio对该病的治疗药物也是AAV2-GDNF。

二． AskBio的技术平台

1. AAV衣壳开发平台：

虽然各种野生血清型的AAV一直能够为基因治疗提供良好的工具，但是AAV精准的组织靶向对于提高AAV介导的治疗效果有着重要的意义。因此AskBio建立了一个集生物信息学分析、晶体结构分析、体内/体外建模和基因组测序技术为一体的AAV衣壳开发平台。他们通过独特的合理设计过程扩展了天然血清型或者其他来源的AAV衣壳的能力，并可以优化新的衣壳使其能够逃避体内抗体的中和反应，以致最终可以应用于单基因疾病、通路疾病、罕见病，以及一系列获得性疾病。

（1）肝素和硫酸乙酰肝素结合嵌合载体

该嵌合衣壳家族包含修饰后的受体识别位点，可改变衣壳的细胞或组织趋向性，显示可介导肺组织中靶细胞的修饰转导。

（2）基于domain swap 的Loop嵌合载体

具有改造后Loop区域的嵌合衣壳在全身给药后显示出新的生物分布和转导模式。例如，一些Loop区域改造后的嵌合衣壳不但可以在保持对其靶组织例如心脏、骨骼肌和脑组织的高水平趋向性 (AAV2i8-Asokan A. 2010 ; AAV2i8g9-Shen S. 2013)的同时，又可以使其在肝脏的脱靶水平减少到只有野生型母体的 1%-10%。这些Loop嵌合载体在针对心肌的临床项目中有着非常广阔的应用前景。

（3）双聚糖受体嵌合载体

除了证明病毒上聚糖受体足迹的模型之外，AskBio还为升级当前用于临床基因治疗的 AAV 载体工具包提供了新的参数。利用这些参数进行诱变和筛选，可以进化出新的可以识别不同宿主聚糖的AAV 衣壳。例如双聚糖结合 AAV，AskBio通过将 AAV 血清型 9 的半乳糖 (Gal) 结合足迹“嫁接”到可以结合硫酸乙酰肝素的 AAV 2骨架上 上，得到了一种双聚糖结合 AAV 病毒株AAV2G9 ，这样既可以利用 Gal 也可以利用 HS（Shen S.，2013）。与亲本 AAV 血清型相比，AAV2G9 可以在体内介导快速和持续、高效的转基因表达。

2. 启动子开发平台：

AskBio 于 2019 年 8 月收购了基因控制合成启动子技术的领导者 Synpromics Ltd，其专有的基于数据的启动子设计和生物信息学技术，为AskBio AAV 基因治疗产品开发提供了重要的支持。AskBio正在迅速地将 Synpromics AAV 启动子技术推向临床，从而实现可诱导、可有组织靶向性地表达目的基因，并且增加目的RNA的稳定性。据称AskBio开发出的表达原件有以下优势：在任何环境或生物条件下稳定表达目的蛋白；表达原件里整合了所有需要的遗传元件，包括 5’UTR、内含子、cDNA 和 3 ’UTR；由于可以设计出较短的调控原件，因此其可以被整合到scAAV当中；对细胞类型、发育阶段或细胞状态具有选择性；可以将启动子原件设计为具有可调节、可诱导或可开关的功能；针对整体尺寸进行了优化，降低了免疫原性，并减少了脱靶的副作用。

另外，AskBio也有着在生物信息学和机器学习方面的深厚积累。他们目前利用数据资源来深入了解基因调控，以准确识别基因组中的新的调控序列并实现了一种独特的启动子设计和构建的方法。AskBio开发的生物信息学引擎 PromPT™ 可为任何细胞类型或响应任何环境、生物或化学刺激提供高效、有数据支持的启动子设计方案。

3. 高产的悬浮细胞生产线：

早在许多生物技术公司投身入 AAV 生产这一业务之前，AskBio认识到一个AAV 基因治疗行业的普遍需求——在AAV生产过程中提高产量和降低成本。2010 年，AskBio推出了 Pro10™，这是一种用于生产医用AAV的大规模生产工艺。这个系统在无血清悬浮培养基中使用基于人胚胎肾 (HEK) 的细胞系，以业内最高的规模和产量开发和生产 AAV 载体。Pro10™可以生产所有血清型和嵌合衣壳，并包装单链和双链AAV基因组，其受专利保护的细胞系在进行瞬时转染时也有着明显的成本优势。

4. dbDNA™开发平台：

目前AskBio正与其伙伴Touchlight Genetics, Ltd.合作，将 Doggybone™ DNA (dbDNA™) 推进到具有广泛开发和制造能力的临床应用阶段。dbDNA™是一种纯体外的DNA扩增和纯化技术。该方法的核心是利用两种酶的活性：利用Phi29 DNA 聚合酶通过滚环扩增来扩增双链 DNA，以及利用原核端粒酶生成共价闭合的线性 DNA，再加上简化的纯化过程，产生只包含目标序列的纯 DNA 产品。该过程以环状双链 DNA 分子（通常为，质粒）开始，该DNA分子包含目标序列，目标序列两侧各有 56 bp 回文原核端粒酶识别序列。然后使该DNA分子变性并激活 Phi29 DNA 聚合酶。Phi29 启动该模板的滚环扩增 (RCA)，创建原始构建体的双链串联重复。接着添加原端粒酶，与目标序列侧翼的识别位点结合并进行切割连接反应，从而产生单体双链、线性、共价闭合的 DNA 构建体。然后添加一组常见的限制性内切酶以切割不需要的骨架 DNA 序列，暴露出开放式的 DNA，可以通过外切核酸酶消化去除这些 DNA。目标dbDNA™ 可以从最终的反应体系中纯化出来。dbDNA™合成 DNA 不需要更大体积发酵菌体，这意味着AskBio可以在没有细菌影响的情况下生成 DNA，与质粒 DNA 相比，dbDNA™可以在更短的时间内大量生产。更重要的是，AskBio可以在更大范围内组装更安全的 DNA 序列，并具有与天然合成 DNA 相同的治疗效果。

撰文|向阳屯铁匠、张爱龙

参考资料

1. https://www.askbio.com/

2. https://clinicaltrials.gov/

3. https://atm.amegroups.com/article/view/25974/html

4.https://www.wsj.com/articles/bayer-to-buy-gene-therapy-firm-askbio-for-up-to-4-billion-11603697401

5.https://www.prnewswire.com/news-releases/askbio-applauds-pfizers-continuing-investments-in-gene-therapy-300905972.html

6.https://insights.bio/immuno-oncology-insights/journal/article/371/doggybone-dna-an-advanced-platform-for-aav-production

E.N.D

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