利用昆虫细胞高表达高生物活性的AAV基因治疗载体
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利用昆虫细胞生产生物制品历史概况
自从1959年成功建立了第一个连续昆虫细胞系以来，大量的研究和开发使得昆虫细胞系成为生产用于研究和临床应用的重组蛋白的主要工具。1971年发现并分离出的加州多核多角体病毒（AcMNPV），是发挥昆虫细胞杆状病毒表达载体系统（IC-BEVS）广泛潜力的重要一步。在随后的几年中，完成了与杆状病毒生物学、感染动力学、基因组序列和结构变体相关的广泛研究。
草地贪夜蛾-SF9/SF21细胞宿主
最初生产用杆状病毒只作为生物杀虫剂使用，随后利用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统因表达广泛的重组蛋白，包括酶、糖蛋白、重组病毒和疫苗而迅速流行。昆虫细胞杆状病毒表达载体系统在生产兽医疫苗（如猪瘟疫疫苗、圆环PCV疫苗、CircoFLEX疫苗）和人类疫苗（如Cervarix®宫颈癌疫苗和Flublock®流感疫苗）中得到了广泛应用。Cervarix®是一种病毒样颗粒的宫颈癌疫苗，该产品获得监管部门的批准（2007年9月获欧盟批准上市,随后于2009年10月获FDA批准上市）是一个重要的里程碑，因为它是第一种在昆虫细胞中生产并批准用于人类的生物制品。
目前，AAV在纠正单基因疾病的基因治疗领域越来越流行。在过去几十年中，基于AAV的基因治疗临床研究稳步增长，这对开发用于AAV制造的昆虫细胞杆状病毒表达载体系统也有着显著的促进作用。从监管角度来看，除2012年欧洲药品管理局批准Glybera®外，Biomarin公司的血友病A基因治疗药物在欧洲有条件获批上市，该产品使用了IC-BEVS在昆虫细胞中产生的重组腺相关病毒5（rAAV5）基因传递载体。
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昆虫细胞可以表达高生物活性的AAV载体
在过去的二十年中，各种分子设计方法被用于利用IC-BEVS平台实现AAV的高效生产。基于该平台的固有优势，积极努力实现更的表达稳定性、提高产量和简化制造流程。目前昆虫细胞表达AAV的载体有三种不同杆状病毒构建体系：三杆状病毒系统Three-Bac, 双杆状病毒系统Two-Bac和一个杆状病毒系统One-Bac。
不同的杆状病毒体系示意图
在AAV的自然宿主哺乳动物细胞中，p40启动子驱动转录的mRNA剪接和VP2起始密码子ACG弱翻译的漏核糖体扫描相结合，导致从mRNA转录物中以1:1:10的标准比率表达VP1:VP2:VP3的三个VP蛋白。VP1携带PLA2样酶域序列和核定位信号，由于它们在AAV转导中的作用，VP1以适当比例表达并随后并入AAV衣壳对生成功能性病毒颗粒至关重要。由于昆虫和哺乳动物细胞中剪接机制的固有差异，在原始的Three-Bac系统中，VP1的真正起始密码子AUG突变为弱ACG密码子，通过昆虫细胞核糖体机械实现三种VP蛋白的表达，其比例与哺乳动物细胞相当。Three-Bac最初对AAV2的开发和生产很成功，但对于其他血清型如AAV5和AAV8则遇到一些挑战。AAV5在昆虫细胞中产生时，表现出较低的转导效率，这与VP1表达不足有关，VP1表达缺陷与AAV5 VP1序列和昆虫细胞的漏扫描效率有关。核糖体扫描将AUG识别为翻译起始密码子的效率取决于Kozak序列：围绕AUG的序列背景，重要的是ACCAUGG，其中+4位的G对于弱起始密码子（如ACG）至关重要（AUG的a为+1）。与AAV2相反，AAV5中+4位的G为U，这被认为是导致VP1在AAV5衣壳中表达不足和随后较少结合的原因。一些研究通过结构域交换解决了这一挑战，其中特定位置的86个氨基酸长的AAV5 VP1序列被AAV2 VP1序列取代，导致AAV5嵌合衣壳具有与AAV2相似的传染性。另外一些研究将整个AAV5和AAV8的VP1序列与AAV2的VP1序列进行了域交换，使得VP1比例和PLA2活性增加，AAV5和AAV8的转导效率恢复到正常水平。
另外，有研究报道了HEK293细胞与昆虫细胞表达AAV的头对头比较，利用衰减的Kozak序列和泄漏核糖体扫描，来改变特定血清型衣壳蛋白比例，结果显示：
①与HEK细胞相比，昆虫细胞表达的VP1，VP2比例增加3倍。
②昆虫细胞表达的AAV5，与HEK细胞表达比较，错包序列/污染序列减少6倍；
③昆虫细胞表达的AAV5，与HEK细胞表达比较，对小鼠脑组织转导活性提高4倍。
SF9与HEK293细胞表达的AAV载体直径和空壳率均表现接近
纹状体注射HEK293和Sf9表达 rAAV5后，注射后三周，通过生物发光（BLI）测定转导效率（荧光素酶和红色荧光蛋白（mApple）的表达），经SF9表达AAV5比HEK细胞表达的载体高出4倍。
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工艺研究提高昆虫细胞平台生产AAV的效率
除了表达系统的分子设计外，生产工艺对于AAV的生产同样至关重要。在典型的昆虫细胞/杆状病毒系统中，细胞状态取决于细胞病毒相互作用和感染动力学、细胞增殖和代谢以及细胞外培养环境。总体结果是在细胞培养过程的动态和生产环境下多因素相互作用的结果。
昆虫细胞生产AAV工艺流程示意图
3.1 杆状病毒载体的感染系数（MOI）
在IC-BEVS中，杆状病毒的MOI对细胞生长速度和存活率、生产动力学、表达的重组蛋白的数量和质量以及培养物的收获时间具有关键影响。低MOI感染和高MOI感染的特点是其感染率不同（同步与异步）以及相关的蛋白质表达动力学差异。病毒载体或病毒样颗粒的表达通常涉及与携带单个成分编码序列的多个rBV共同感染细胞培养物，这给生产过程增加了另一个复杂性。改变多个杆状病毒的MOI及其感染时间通常会导致衣壳组成的改变。
安龙生物在工艺开发过程中采用DOE实验设计，对MOI参数进行优化，从实验结果分析，表达衣壳蛋白的杆状病毒用量远高于表达目的基因的杆状病毒，这是整个培养系统资源分配的结果。说明过量的衣壳蛋白有利于基因组滴度的提高，并且我们的测试结果其生物活性也是最好的。
3.2 感染时细胞密度的影响
重组蛋白表达的细胞特异性产量下的细胞密度，是为生产批次选择感染时间和感染时细胞密度的重要指标。这在许多研究中被称为细胞密度效应或感染时间。就昆虫细胞杆状病毒系统而言，这一关键指标是生产阶段由MOI确定的总营养可用性、细胞生理状态以及受感染细胞群体与培养物中总活细胞的比率（即同步与异步）的结果。
安龙生物在工艺开发过程中，研究了不同的细胞密度及接毒后病毒培养时间对收获液AAV载体的滴度影响（如上图所示），这为优化和确定相关工艺参数奠定了坚实基础。
3.3 上游培养模式的影响
在批培养模式下运行的低细胞密度培养过程通常会导致AAV的体积产量较低，因此需要大规模生产生物反应器，以满足后期临床阶段研究的高需求。当与持续的细胞特异性产量相结合时，在补料或灌注操作模式下的高细胞密度培养过程提供了一种提高体积产量的方法。这两种模式均已成功实现Sf9细胞的高细胞密度培养。补料过程中的营养喂养策略旨在将细胞维持在中指数期一段持续时间，以在感染前达到高细胞密度。在感染后阶段与营养喂养相结合，代谢限制得到缓解。
有研究文章表明，当在三杆粒BV共感染SF9细胞时，新鲜培养基的替换策略实际上模拟了摇瓶规模下的灌流培养模式，结果显示不同细胞密度下的体积产率线性增加，而单细胞AAV特异产率没有任何损失。当在3L生物反应器中进一步放大时，在新鲜培养基中以250万个细胞/mL的密度感染Sf9细胞，达到类似的单细胞AAV产率；进一步研究中，与对照的批培养低细胞密度工艺相比，培养基替换加上以500万细胞/mL感染高MOI的三杆粒（每种3 MOI）导致基因组AAV滴度增加约三倍。
3.4温度的影响
细胞培养温度对优化细胞代谢、蛋白质生产和加工至关重要。温度调节策略通常用于改变细胞代谢、糖蛋白变体的产生及其加工。一些研究表明，昆虫细胞最好在27°C至30°C之间生长。有报告研究在不同温度下（21、24、27、30和33°C）使用三杆粒感染Sf9细胞中产生AAV的情况，结果显示30°C时AAV产量最高，分别比27°C和低于27°C的时高2.5倍和5倍。然而，在不同温度下达到的最高细胞密度没有显著不同。
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安龙生物昆虫细胞/杆状病毒体系生产AAV进展
安龙生物在昆虫细胞/杆状病毒表达系统生产AAV上积累了丰富的经验，工艺和生产团队通过sf9昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法获得AAV产品，这是基因治疗行业内规模化生产的突破性进展。结果显示：收获液中AAV滴度较小试研究阶段提高了近60%，生产总收率达到50%以上，产品显示出较高的生物学活性，纯度达到了98%以上，病毒产量高达2E+16vg，DS/DP检测指标均符合质量标准。安龙生物利用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统在200L规模上生产AAV病毒载体媲美国际水平，更是成为国内首家利用该系统完成200L规模AAV病毒载体下产（单罐）的企业。
生物制品的生物安全性一直是监管部门关注的重点，各国监管机构及ICH都有相应的指导文件来指导生物制药企业对原料、中间产品、制成品及工艺进行相关检测和验证。2014年首次报道了在昆虫细胞中发现了一种新型的内源性弹状病毒，FDA也在一封沟通信中要求有的生物制品，包括来源于细胞的生物制品，例如SF9，必须进行适当的检测确保起安全性，这包括了对工艺进行的验证以证明对外源病毒的去除能力。
安龙生物自主筛选、开发出了一株无弹状病毒的昆虫细胞株，经过对不同代次细胞使用PCR、NGS和质谱等不同方法交叉检测，确认使用的细胞没有内源性的弹状病毒。同时，对筛选出的无弹状病毒昆虫细胞的杆状病毒生产能力、AAV病毒包装能力和产品质量进行全面表征和验证，各项指标与原始昆虫细胞株没有显著差异。
关于安龙生物
安龙生物是一家致力于基因治疗产品生产技术开发和应用的生物技术公司，能够为基因治疗产业化提供完整的解决方案。
安龙生物特有的无弹状病毒昆虫细胞-杆状病毒生产AAV（腺相关病毒）技术平台，一方面提高了生物制品安全性，同时更重要的是能够显著降低基因治疗产品的生产成本。公司同时拥有其他生产技术平台和完备的技术转移团队，为客户的开发和生产需求提供多样化的工艺路径选择。
安龙生物建有完备的分析科学与质量控制能力，拥有理化、微生物、基因和活性 4大检测平台，全面支持工艺开发、工艺优化、药品原液和制剂的各种检测需求。
公司已建成的GMP厂房达5000平米，能够为客户提供质粒、AAV（腺相关病毒）和LV（慢病毒）工艺开发、生产、临床申报和法规支持等一站式CDMO服务。
业务联系方式
官方邮箱：info@anlongbio.com
电话：010-80414166
参考文献：
1. Advancements in Insect-Cell Baculovirus Expression Vector Platform for Production of Recombinant Adeno-Associated Virus-Based Gene Delivery Vectors,Pranav Joshi , Alina Venereo-Sanchez, Parminder Chahal, and Amine Kamen
2. Direct head-to-head evaluation of recombinant Adeno-associated viral (rAAV) vectors manufactured in human vs insect cells. O. Kondratov, D. Marsic, S.M. Crosson, H.R. Mendez-Gomez, Molecular Therapy, 2017.08
E.N.D
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