应用于mRNA疫苗及药物中的分析技术

作者：CYNTHIA A. CHALLENER

本文编译自《制药技术》杂志

mRNA技术的许多应用正在通过临床前研究和临床试验迅速发展。

与所有候选药物或疫苗一样，拟议的mRNA产品必须符合国际协调会议（ICH）、世界卫生组织（WHO）、FDA、欧洲药品管理局（EMA）和全球其他卫生主管部门概述的分析表征的监管要求。

与大多数其他药物材料不同，mRNA必须在专门的纳米颗粒中配制，通常由脂质组成，保护其免受酶的降解以促进其在细胞膜上的运输。同时，还需要进行更多的分析来确保纳米颗粒配方以及mRNA分子本身的质量和安全性。

mRNA疗法早期开发阶段的一个关键步骤是对mRNA和纳米颗粒质量属性的广泛表征，因为众所周知，这些属性会强烈影响生物效能。鉴于药物开发的时间线越来越短，获得更快、更高通量的分析方法变得至关重要。事实上，在mRNA产品开发和质量控制（QC）测试期间使用的分析方法必须不断跟上步伐，以确保这些新的预防和治疗方法的一致性、安全性和有效性。

广泛的分析需求

虽然对mRNA候选物的分析要求比传统生物制剂更复杂，但有些测试需求是相似的，而另一些则截然不同。

“蛋白质疗法和mRNA疗法通常都需要充分表征，以全面地识别和量化任何会影响其功效和安全性的质量属性，” SCIEX生物制药领域质谱分析全球营销经理Todd Stawicki说。他指出，需要识别过程相关的杂质——如蛋白质疗法中的宿主细胞蛋白（HCPs），和mRNA中的各种遗传杂质，如截断的转录本或不正确的DNA模板。

然而，差异是显著的。“与蛋白质疗法的专注于翻译后修饰不同，在mRNA药物开发的发现阶段，就非常强调mRNA转运系统和细胞摄取的表征，因为与工程蛋白和单克隆抗体（mAbs）不同，mRNA一旦转运到细胞内，就会立即产生指令，生成有活性的蛋白质。”新加坡安捷伦科技公司解决方案开发科学家 Brian Liau表示。

此外，mRNA产品的生产需要独特的工艺步骤，如体外转录（IVT）和脂质纳米颗粒制剂，这自然会产生不同的分析需求，康泰伦特质量控制经理Ryan Hanko补充道。IVT是一种化学过程而不是基于细胞的过程，沃特世生物制药高级业务发展经理Joe Fredette阐述道。它还涉及一种称为RNA聚合酶的酶，可将DNA转录成mRNA。

作为不同分析需求的一个例子，Hanko指出：“mRNA产物需要进行QC分析，来测量在IVT步骤后可能存在的残留酶（如聚合酶或核酸内切酶），以确保其不存在于最终产物中。“Intertek Pharmaceutical Services业务开发总监Ashleigh Wake指出：“确认RNA序列以及5'端的加帽效率和3'端的poly（A）尾巴结构分布也是mRNA所特有的。”潜在的杂质谱也与其他分子有很大的不同，并且还需要使用到任何残留质粒或双链RNA的定量测定方法。

此外，根据Fredette的说法，脂质分析工作流对于mRNA产品的表征及化学成分生产和控制（CMC）测试是非常有必要的，包括脂质纳米颗粒（LNP）成分分析，以确保配方中脂质的正确混合比例，脂质ID确认以及杂质分析和筛选。

Wake总结说，从本质上讲，产品表征的总体要求是相似的，目的是评估或确认其种类，纯度/杂质，稳定性，活性等。“然而，”她强调说，“为了完全实现这一目标，有必要包括mRNA特异性分析，从而对这些属性进行评估。”

从开发的早期到后期
逐渐演变的分析需求

蛋白质和mRNA产品开发的另一个重要区别是早期发现阶段的分析负担。Liau博士说，由于传统的药物开发通常涉及单克隆抗体，生物分析的要求往往相对适中，因为即使是次优的分子也可能被用于证明靶向作用和治疗效果。

相比之下，mRNA产物需要几个生物学过程，包括细胞摄取，内含体释放和蛋白质翻译有效地进行，才能观察到任何效应。因此，mRNA的分析表征和转运载体的质量属性从一开始就很重要。

“对于拓展工艺和GMP[良好操作规范]制造/产品发布，mRNA的化学表征仍然很重要。然而，重点往往转向确保配方产品中分子量均一的分散性和mRNA封装，以及识别与工艺相关的杂质，”Liau博士评论道。

对于mRNA候选药物，Stawicki补充说，酶促过程的复制拓展需要对所有上游原材料进行大量且十分困难的拓展 - 核苷三磷酸（NTPs），酶，加帽试剂，辅因子和多类脂质。“这些成分中大多数是大型，复杂的生物分子，在自身的复制拓展，纯化和分析上有一定的挑战。”他解释说。

根据Hanko的说法，在生产过程中监控的属性也存在一些差异。A260法测定浓度和渗透压测试是早期开发和拓展工艺过程中用于观察的主要监测手段，而在GMP生产期间，RNase污染检测对于确保最终产品不会因非产品材料的偶然污染而受到影响是非常重要的。

核心的发布测试包括药品鉴定、最终浓度、杂质含量（例如残留蛋白、dsRNA、rDNA）、加帽效率和多聚A尾，以及典型的药典安全性和质量属性评价。

药品关键质量属性

以下为广泛使用的必须监测的关键质量属性列表 (CQA) ，以满足有关评估mRNA治疗/疫苗产品的鉴别、有效性和安全性的监管要求（见表I）。“需要确认已经生成特定的mRNA序列，mRNA溶液处于目标pH值，并且确保已控制任何潜在的工艺杂质（溶剂，蛋白质，DNA杂质）。”康泰伦特质量保证高级专家Matthew Howard说。

Howard说，还需要保证5'端帽子结构和poly-A尾巴结构具有充分的促进翻译和防降解特性。Wake解释说，5'末端的加帽效率可以影响靶蛋白的生成和整体的免疫原性，而poly-A尾巴结构的长度/分布对于mRNA的翻译和整体防护作用至关重要。

康泰伦特质量控制高级科学家Maxwell Meller补充说：“mRNA分子的5'端加帽对于其转运到靶部位时的完整性至关重要，与其他类型的药物相比，这是mRNA药物生产的独有要求。然而，对帽子结构的表征和监测已被证明需要投入大量的时间和资源。”

根据Fredette的说法，对于脂质成分，鉴定LNP混合物中每种脂质的成分以及它们正确的比例至关重要，因为这些CQA可以直接影响LNP的组成和功效。他强调，确保脂质杂质被很好地控制在临界阈值及以下也同样重要，因为脂质杂质和mRNA杂质都会对产出结果产生不利的影响，并在某些情况下降低mRNA的效能。

无RNase区的需求

由于mRNA对酶（尤其是RNase）降解的敏感性，在使用基于mRNA的疗法和疫苗时会产生额外的独特要求。

例如，Hanko观察到，使用RNase消除制剂至关重要，实验室在人员培训和增强对无RNAse区、设备和个人防护设备（PPE）的维护意识的基础上，还应考虑物理空间隔离。

Hanko说，这些措施很重要，因为受损的mRNA样品在测定中将显示出低于预期的纯度。一些分析，如残留杂质的分析，可以说不受受损mRNA的影响，而其他分析可能只需要更高的RNase灵敏度，具体取决于溶液的制备和材料的操作。“即便如此，”Hanko说，“无论所需的缓解程度如何，都必须了解所有方法的核心方法的性能预期。”

时间往往是最大的敌人

mRNA分析面临的最大问题之一也是生物制药行业所全面经历的。“这里最大的敌人是时间，”Stawicki坚称。“不幸的是，目前的许多功能和生物物理测试仍然太慢，无法在允许干预该过程的时间范围内得出可操作的答案。”他解释说。

例如，Stawicki强调了基于细胞的功能分析，这是当今的金标准。“这项试验结果是表明一切进展顺利的最好的早期迹象，”他说。“你将你配制的mRNA LNP注射到细胞内，看看是否能获得足够的正确蛋白质或抗原产量。问题是可能需要几天时间才能读取结果。因此，开发人员不得不在没有分析数据支持其工艺参数的情况下，冒着风险进行工艺。”

早期开发过程中多种补充技术的使用

mRNA产物的生物分析需要结合传统的和新型的分析方法和技术。Hanko重申，它还需要控制和消除可能损害产品完整性的RNase酶。

各种各样的分析技术可用于评价这些属性。Stawicki感兴趣的是，他们来自不同的背景。如从蛋白质疗法表征发展而来的高效液相色谱法（HPLC）和质谱法（MS），源于经典的分子生物学应用的电泳技术（最著名的是毛细管电泳），来自聚合物分析或材料实验室使用的颗粒粒度测定技术。

“由于mRNA治疗药物是分子量较大的异质复合物，它实际上归结为哪些部分或候选药物的哪些部分需要表征，”Stawicki评论道。对于mRNA组分，他指出毛细管电泳甚至平板凝胶电泳方法为首选。对于脂质和LNP的表征，通常选择带电气溶胶检测（CAD）的HPLC或LC-MS。对于完整的mRNA-LNP复合物，首选粒径测定或冷冻电子显微镜等技术。

Liau博士说，早期开发过程中的一些常见操作包括mRNA密码子的优化和最佳5'和3'非编码区（UTR）的选择。由于需要从文库中克隆编码序列，并将它们结合到具有不同UTR的多个质粒中，因此Sanger测序、毛细管或平板凝胶电泳以及聚合酶链反应（PCR）仍然是这一开发阶段的主流分析方法。

根据Fredette的说法，药物mRNA成分的表征和CMC测试包括一系列核酸（DNA / RNA）分析工作流程，以进行mRNA的鉴别和确认其纯度，包括5'帽子结构分析，Poly-A尾部分析，寡核苷酸图谱（类似于肽图谱，但适用于核酸）和基于MS的测序。

Wake指出，与此同时，MS还用于确定关键的质量属性，如加帽效率和Poly-A尾部分布。她补充说，所有这些分析都是在更传统的质量控制要求之外进行的，例如测定[紫外线（UV）/ HPLC）]分析，残留溶剂，金属等。

为了确认候选mRNA的生物学活性，使用阳离子或可电离脂质充分研究的脂质转运系统可用于体外转染标准细胞系。“对于这种早期实验，”Liau观察到，“通常没有必要使用高纯度的mRNA或脂质纳米颗粒的单分散制剂。相反，而是用体动态光散射和zeta电位测量来确保纳米颗粒具有大致正确的尺寸和表面电荷特性，以实现有效的细胞转染。然后视情况而定，通过荧光显微镜，酶测定或免疫染色来确定生物活性。”

后期开发过程中需寻找
更为简单而强大的解决方案

Fredette观察到，从开发早期到GMP过程通常会使用类似的分析技术。例如，LC和LC-MS工作流为开发的所有阶段和生产过程监控带来了价值。

然而，由于工艺优化和复制拓展阶段的目标通常与早期开发研究的目标大不相同，因此Liau评论说，在某些情况下需要不同的分析技术。“在工艺优化和规模化过程中，mRNA序列是固定的，其生物活性是已知的，重点是监控和/或改善工艺产量和mRNA质量属性。”他说。

Liau补充说，LC-MS对于监测体外转录反应的进程和确定关键质量属性（如5'加帽）的状态方面都非常有用。同时，基于分离的技术，如体积排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）和场流分馏（FFF）-MALS，可用于监测LNP的性质和优化络合过程。

Meller同意Stawicki指出的一个重要趋势，包括在蛋白质疗法中，即随着项目流水线的深入，越来越多的人倾向于使用更强大和更简单的技术。例如，他指出，虽然LC-MS是一种卓越的表征和测定加帽成分的工具，但一种更简单的方法更适合常规使用。“在QC环境中，”Meller说，“色谱分析必须精简为HPLC测定，以优先考虑数据分析的速度和效率。”

总的来说，Wake认为，与用于其他形式的方法相比，许多用于完全解析mRNA的方法或途径在QC领域都是全新的。“为了充分支持所有监管要求，有必要更多地使用下一代测序等不属于GMP环境中典型运行的技术。”她解释说。

然而，考虑到加帽等其他因素，Wake表示，所使用的技术更为熟悉，并且很大程度上基于MS。即使在这些情况下，她也表示，整体样品的制备方法仍然是新颖且具有挑战性的。“我们和其他实验室正在开展大量工作，以开发平台方法，来克服这些挑战，同时考虑到最佳的科学技术、数据质量和法规依从性。”她总结道。

正在进行的重大创新

事实上，人们在发展mRNA疫苗和疗法的分析方面付出了巨大的努力。“几十年来科学家们一直在研究mRNA，但很多工作都集中在优化分析方法上，以实现生产级技术。随着基因疗法的爆炸式增长和当下人们对mRNA的浓厚兴趣，你可以看到科学家和医疗器械公司都进行了大量的投资和创新，以开发出最佳的分析解决方案来支持这项工作。”Stawicki认为。

例如，SCIEX已在ZenoTOF 7600中引入了电子活化解离（EAD）作为一种新的MS裂解技术。根据Stawicki介绍，该公司最初推出的是小分子和蛋白质疗法，后来了解到EAD技术在分析mRNA产品方面也很强大。“EAD对于寡核苷酸和LNP表征都具有惊人的实用性，例如，允许在单个实验中对脂质进行灵敏性和完整性的结构表征，包括双键位置和异构体构型。”

Stawicki还提到了SCIEX的新型BioPhase 8800多毛细管CE电泳仪，该仪器允许对相同或不同的样品同时进行多达8次分析。“我们正在探索如何利用BioPhase的高通量能力，用于各种不同的mRNA应用。”他说。

Liau表示，安捷伦最近开发了一种改进的方法，用于通过 LC-MS 快速分析 mRNA 5' 加帽效率。这种分析需要对mRNA大分子进行酶解反应。已有的方法包含两个具有挑战性的样品制备步骤：使用生物素标记的寡核苷酸探针进行亲和捕获，以及使用RNase-H对亲和捕获的mRNA进行定点切割。

Liau表示，安捷伦最近开发了一种改进的方法，用于通过 LC-MS 快速分析 mRNA 5' 加帽效率。这种分析需要对mRNA大分子进行酶解反应。已有的方法包含两个具有挑战性的样品制备步骤：使用生物素标记的寡核苷酸探针进行亲和捕获，以及使用RNase-H对亲和捕获的mRNA进行定点切割。

由于亲和纯化效率低下，该方法无法可靠地用于某些mRNA序列，因此安捷伦开发了一种改进的样品制备方法，包括在溶液中进行定点切割，无需亲和捕获，然后使用硅基柱纯化切割后的寡核苷酸和mRNA样品基质。使用热稳定版本的RNase-H酶也可以缩短样品制备时间。

样品制备、分析和数据处理的整个过程，只需要75分钟，并且可以从mRNA样品基质中分离出感兴趣的寡核苷酸，而无需进一步的样品净化。“当与特殊设计的冲洗方案结合使用，以减轻样品基质在色谱柱上的堆积时，该方法体现出了良好的线性，灵敏度和复现性。”Liau说。

Howard强调了目前正在改进的几种有前途的技术，用于评估细胞中的蛋白质表达，例如用于检测细胞内dsRNA水平的流式细胞术和表达蛋白质的抗原特异性荧光检测，这两种技术都能快速检测细胞摄取、RNA扩增、蛋白质表达和生产。“这种直接测量方法可以缩短体内抗原研究的周转时间。新技术当然看起来很有前途，并可能在未来几年内切实可行。”他相信。

而Wake则将注意力重新放在NGS技术上；尽管它已并不陌生，但在GMP环境中，对于mRNA产品，引入NGS对于实现所需的质量控制至关重要。同样，她说电子显微镜是评估封装产品的一项基本技术和建立体外释放性能的方法。然而，这需要对主要与美国药典4 型溶出试验相关的试剂盒进行调整。

Wake也重申了开发平台分析技术的重要性。她说，平台方法的持续改进是非常有帮助的，对于确定mRNA是否真正在正确的脂质体内部pH环境下封装在纳米颗粒系统中，以支持早期产品而无需进一步研究。随着产品进入后期阶段，这些相同的方法将得到优化，并最终针对每个特定产品进行验证。“然而，”Wake认为，“在开发周期中尽早了解这些关键方面，就需要采取一种通用的方法。”

mRNA分析仍然任重而道远

重要的是，mRNA技术本身正在迅速发展并不断演变。因此，mRNA药物和疫苗分析方法的开发人员不仅面临着这些生物分子及其运载工具的复杂性的挑战，并且还需要开发灵活的方法，以适应mRNA 结构和最终配方的持续变化。

例如，Wake指出，虽然迄今为止mRNA产品已被开发为注射剂，但吸入和鼻腔给药提供了可行的替代方案。“这样的给药途径不仅有助于提高生物利用度，而且即使在没有医疗保健服务指引和管理体系的情况下，患者也可以以更简单的、更爽快的方式自行给药。”她解释说。

Fredette建议，科学家应该考虑随着行业的发展，他们需要在组织中部署的分析平台和工作流程，以及如何最好地协调一切，从方法开发到方法/数据传输；确保数据的完整性、可追溯性和合规性；达到他们预期和需要的服务和支持水平。

“我甚至不认为我们已经开始接近mRNA疗法分析的稳定状态，” Stawicki说。“自从Moderna的elasomeran（Spikevax）和辉瑞-BioNTech的tozinameran（Comirnaty）成为改变世界的疫苗，我们认为mRNA疗法的发展空间正在快速地增长。许多公司现在正在开发mRNA的变体，例如自扩增mRNA和环状mRNA。此外，科学家们正在研发新型载体和mRNA靶向治疗的策略。所以，是的，我们仍然处于这场技术革命的初始阶段。”他总结道。

E.N.D

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