赵方庆等 | 8000字讲透单细胞宏基因组学！
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2018年5月，Protein & Cell 杂志特别为中国肠道大会推出了主题为“Microbiota and Human Health”的专刊，邀请于君、傅静远、马永慧、王军、张发明、赵方庆、陈峰、王则能、聂勇战等9位教授领衔发表了9篇综述和评论文章，并由刘志华教授撰写卷首语。
Protein & Cell 杂志是开放获取期刊，所有文章的pdf版本都是免费下载的，大家可以点击访问 http://www.protein-cell.org/archive/index-2018-5.html 获得该期专刊的英文版原文。
今天我们发出来自中国科学院北京生命科学研究院赵方庆教授的综述的翻译稿。我们特别感谢英国帝国理工学院在读博士生陈绮翎同学为翻译本文所付出的辛勤努力。
2018年5月12日，赵方庆教授曾在国家会议中心的中国肠道大会上系统讲解本综述，大会的付费参会者和演讲嘉宾可访问 http://www.mr-gut.cn/videos/show/9057031827 观看讲解视频。
希望能帮到你涨知识，不用谢，我们都是热心肠！
单细胞宏基因组学：挑战和应用
Single-cell metagenomics: challenges and applications
作者：Yuan Xu, Fangqing Zhao（赵方庆）
通讯作者：赵方庆，zhfq@biols.ac.cn
关键词：宏基因组学，生物信息学，单细胞基因组学
译者：陈绮翎同学（英国帝国理工学院在读博士生）
摘要
随着高通量测序和单细胞基因组技术的发展，许多不可培养的微生物群落已经可以通过两种技术联用来深入研究。
尤其是通过同时利用单细胞基因组学和宏基因组学，研究人员能够极大地提高从复杂微生物群落中获取全部基因组信息的效率和准确性。
这不仅可以识别微生物，还可以把功能和物种联系起来，识别亚种差异，研究宿主-病毒相互作用等。
在这里，我们回顾近期单细胞宏基因组学的进展和挑战，包括潜在的污染、不均衡的测序覆盖度、序列嵌合体、基因组组装和注释。
随着测序和计算机技术的发展，无疑将扩大单细胞宏基因组学在各种微生物组研究中的应用。
前言
近年来，随着测序技术的发展和生物信息学的进步，高通量测序已经被广泛应用于不同环境中微生物成分、功能、进化和相互作用的研究中。
它直接促进了微生物生态学的蓬勃发展，产生了许多有用的科学成就，尤其是在肠道菌群和人类健康领域。
根据需要解决的问题，环境微生物学使用的测序技术主要分为靶向测序、宏基因组测序和单细胞基因组测序。
靶向测序也被称为扩增子测序，是针对微生物特定标记基因的测序，如16S核糖体RNA（16S rRNA）、内转录间隔区（ITS）、氨单加氧酶亚组A基因或甲基辅酶M还原酶a亚组基因等。
16S rRNA基因是靶向测序中最受欢迎的标记基因，因为我们可以通过将阅读子分配给诸如greengenes（DeSantis等，2006）、SILVA（Quast等，2013）或RDP（Cole等，2014）等已知16S rRNA数据库的分类谱系，解决微生物生态学中的一个重要问题——“谁在那里？”
但是，16S rRNA扩增子无法在菌种或菌株的分辨率水平上鉴定细菌，而且我们无法直接确定这些微生物的功能。
宏基因组测序也被称为环境基因组测序或群落基因组测序，指的是对环境中所有微生物的全基因组测序。
这个方法能够根据诸如NR、KEGG（Kanehisa等，2008）、eggNOG（Huerta-Cepas等，2016）等已知的功能基因数据库注释测序结果，帮助回答微生物生态学中的两个重要问题——“谁在那里？以及它们在做什么？”
这种方法的主要优势在于，在高分辨率水平上为群落结构和与微生物群落的潜在代谢途径提供更加丰富的信息（Liu等，2013）。
但是，难以进行宏基因组组装和功能注释是宏基因组测序的瓶颈，与16S rRNA扩增子测序相比，它还无法提供相应的的微生物组成信息。
为了克服这个缺陷，Zhang等人近期提出了一个RiboFR-Seq方法，可同时抓取16S rRNA可变区域及其附近蛋白编码基因（Zhang等，2016），进而识别出宏基因组重叠群和16S rRNA谱系之间的对应关系。
此外，Spencer等人发展了一种名为epicPCR（乳液、配对分离和连锁PCR）的新技术，用于在不可培养的单细胞中将功能基因和系统发育标记物联系起来（Spencer等，2015）。
但是，这两个方法仅部分的解决了这一问题，并不能将一种微生物的所有功能基因和其系统发育联系起来。
因为靶向测序和宏基因组测序的弱点，单细胞测序正逐渐成为一种强有力的补充方案，旨在单细胞水平上对目标细菌进行测序。
单细胞基因组测序的第一步是使用连续稀释、微流体学、流式细胞术或显微操作将单个细胞从环境样品中分离出来。
接下来进行DNA提取、16S rRNA基因PCR技术鉴定系统发育信息、多重置换扩增（MDA）、文库构建、测序和数据分析。
这个方法的最大优势在于，它可以很容易将代谢功能和特定菌种联系起来。
而且，这个方法可以给低丰富度的菌种提供高质量的基因组，而如果使用宏基因组测序，这些信息就会丢失。
通过使用组装的基因组，研究人员能够研究不可培养细胞的基因组重排、基因插入、重复、基因丢失、种内差异和病毒-宿主相互作用。
这种方法有以下不足：
首先，细胞分选过程繁琐且耗时；
其次，MDA的流程会导致高度不均衡的测序序列覆盖率和嵌合体比例增加；
最后，受污染的细菌或DNA可能会导致实验在中途无法继续进行下去。
综上所述，这些测序技术各有其优缺点，在实际操作中可以互为补充。
比如，宏基因组测序不受单细胞基因组学的细胞分选、嵌合体和不均衡的测序覆盖率等问题的困扰。
同时，单细胞基因组学能够为菌种和它们的功能提供直接的联系，而这在宏基因组测序中是个需要解决的重要问题。
两项技术相互结合可以极大地改善它们各自的不足。
比如，单细胞基因组学能够给宏基因组学数据归类提供系统发育学、核苷酸频率成分和基因成分的信息。
反过来，宏基因组学阅读子和重叠群能够显著改善单细胞基因组装配（Blainey，2013；Dodsworth等，2013；Becraft等，2015；Jia等，2017）。
在这里，我们将回顾和讨论实验和分析流程（图1）以及单细胞基因组学和宏基因组学联用时可能遇到的挑战。
图1.单细胞宏基因组学的工作流程
使用MDA的全基因组扩增
考虑到一个细菌细胞通常只含有毫微微克（10的-15次方克）的DNA，而高通量测序的最低要求是微克（10的-6次方克），因此全基因组扩增是单细胞基因组的必要步骤。
MDA广泛应用于单细胞全基因组扩增，在等温的条件下，利用随机六聚体引物和Phi29DNA多聚酶合成大型DNA片段（图2A）（Blanco等，1989；Yilmaz和Singh，2012）。
Phi29 DNA聚合酶能够通过简单的分支迁移反应置换下游5’-末端DNA链，延伸3’-末端DNA链（Chen等，2014），3’-末端也可以通过类似的方式被置换（译注：即具有多重置换和连续合成活性）。
但是，这个方法也有其自身的局限性，比如错误扩增污染物、形成扩增嵌合体（Lasken和Stockwell，2007）和产生不均匀的测序覆盖度。
然而，所有的这些错误很大程度上都可以通过下游的计算分析解决。
最近，一个新的MDA方法（Stepanauskas等，2017），WGA-X，利用一种热稳定phi29变异聚合酶，复原了很多单细胞基因组，是改进单细胞基因组获取的好方法。
(A）引物Phi29 DNA聚合酶与DNA退火并通过Phi29 DNA聚合酶延伸。Phi29 DNA聚合酶可以通过简单的分支迁移反应置换下游的5'-末端DNA链以延伸生长3'-末端链，并且3'-末端也可以以类似的方式置换。
（B）四种嵌合体类型。I：第二段从其原始方向反转并在第一段之后直接连接。II：第二段从其原始方向反转并在第一段之前直接连接。III：两个同向段直接连接。IV：两个同向段相反连接。
去除被污染的DNA和序列
DNA污染是一个需要在MDA之前解决的主要问题之一，因为MDA操作可能会扩大污染，并最终导致实验的失败。
通常情况下有三种污染来源（Yilmaz和Singh，2012；Blainey，2013），细胞分选步骤中被污染的样品，被污染的实验试剂和仪器和实验过程中的环境污染（Blainey，2013）。
有三种解决方案，综合使用可以很大程度上消除这些污染。
第一种解决方案是使用严格的清洁措施处理实验环境，包括使用环氧乙烷处理实验室的一次性耗材（Shaw等，2008），热敏DNA核酸酶（Champlot等，2010）或紫外辐照处理试剂或HEPA过滤环境空气（Woyke等，2011）。
第二种方案是减少反应体积，这将增加单细胞微生物DNA和被污染DNA的比例，因而减少了试剂来源的污染（Rinke等，2014）。另外，实验还必须要设置负对照组。
最后一种解决方案是使用计算方法在测序后识别并去除污染的DNA。比如，可以通过把所有的阅读子和譬如人类或现有的微生物基因组序列的模式基因组进行匹配。
但是，如果被污染的基因组和目标基因组较为相似，这种方法有丢失它们共有序列区域的风险。
另外，基于四聚体频率的成分分析也可以被用来去除被污染序列（Woyke等，2009）。它的缺点在于计算量很大，而在基因组组装后做这一步可以降低计算成本。
不均衡的基因组覆盖度
单细胞基因组学中另一个重要的问题是不均衡的基因组覆盖率，这是由随机引物的结合以及MDA步骤中一些基因组区域的优先扩增（Dean等，2001；Hosono等，2003；Raghunathan等，2005；Zhang等，2006）引起的。
有两个方法可以解决不均衡的基因组覆盖问题。
一种方法是通过优化实验流程如减少反应体积的，提高MDA的有效模板浓度（Marcy等，2007）或者将同一物种的DNA样品组合用于MDA扩增（Raghunathan等，2005；Kvist等，2007）或者在MDA之后基于序列的重退火动力学，使用双链特异性核酸酶降解高丰度序列（Yilmaz和Singh，2012）。
这个方法不仅改善了阅读子覆盖范围的均衡性，也能提高目标基因组的覆盖率（Rodrigue等，2009）。
另一方法更常见，常用于宏基因组组装之前，它可以通过如基于k-mer深度筛选和数据修剪（Rodrigue等，2009），使测序读取标准化，从而去除或修剪具有高丰度或独特k-mer的读取（Swan等，2011）。
一些单细胞基因组的组装软件在它们的算法中内嵌了这个步骤，如SPAdes（Bankevich等，2012），EULER+Velvet-SC（Chitsaz等，2011）和IDBA-UD（Peng等，2012）。
MDA造成的嵌合片段
序列嵌合体是MDA引起的另一个重要问题，在扩增的过程中，同一或不同基因组的同一区域可能会被错误地扩增到同一片段中。
Lasken和Stockwell归类了大肠杆菌单细胞测序研究中不同的嵌合种类以及它们的形成机制（Lasken和Stockwell，2007）。
根据结果，MDA的嵌合体可以被分为图二B中的四种类型。
当对比模版基因第二个片段从它原本的方向上被反置时，前两种嵌合体就会出现，占了总嵌合体的85%。
后两种为同一方向上加入两个片段，占了总嵌合体的15%。
这两个片段的顺序也可以在DNA重组的时候被倒置过来。
也就是说，嵌合体中第一个片段能够被加入到基因组序列的上游或下游中（图2B）。
一旦出现了嵌合体并被测序，就会出现DNA重组和下游基因组组装的复杂化。
因此，我们需要识别它们，并在基因组组装之前使用生物信息方法把它们移除。
基于参考基因组的嵌合体检测是减少这种嵌合体的主要策略。
考虑到一些单细胞测序的微生物可能缺乏参考基因组，单细胞基因组学和宏基因组学的结合能弥补这个缺陷，组装的重叠群能够作为参考基因组来改正嵌合体。
近期，Marshall使用Newbler的迭代“jackknife”程序，在没有参考基因组的帮助下，去除了MDA过程中产生的嵌合序列（Marshall等，2012）。
几种算法和技术如UCHIME（Edger等，2011）和DECIPHER（Wright等，2012）使用序列频率信息来检测嵌合体，并能高效鉴定扩增子序列中的嵌合序列，这是基于嵌合序列在特定数据集中的出现频率比在正常扩增要少很多的合理假设。
单细胞基因组的组装
过去的几年里，微生物基因组数据迅速积累增加。但是，完整的微生物基因组的增加速度慢许多。
主要的原因是宏基因组组装中短序列读取、高复杂性和环境样品的不均衡性等限制因素。
组装是将重叠的短读取融合形成连续的长序列。现在组装的算法主要基于阅读重叠或de Bruijn图方法，这两种方法结合使用是高通量序列基因组项目的主要方法（Shi等，2017）。
从包含多种微生物的环境样品中获得完整的微生物基因组很难。
通常情况下，研究人员只能获得一堆主要为基因的数据，很难确定哪些基因聚集在单个生物中。
有时，当样品很简单时，比如极端环境样品或富集样品，研究人员可能能获得高丰度微生物更完整的基因组。
比如，大规模测序使得研究人员能通过富集水稻土壤样品获得完整的产甲烷古生菌基因组（Erkel等，2006）。
类似地，Garcia Martin等从强化生物除磷工艺（EBPR）的活性污泥样品中获得了Candidatus Accumulibacter phosphatis菌株UW-1 的基因组草图（Garcia Martin等，2006）。
但是，人们很难获得这些样品中稀有菌种完整的基因组，并且通常情况下，由于亚种或基因水平转移，组装得到的基因组只代表泛基因组。
宏基因组和纯培养物分离物的掺加实验显示，当纯培养物至少20倍于宏基因组浓度时，人们才能够从宏基因组测序结果中获得菌株基因组保有的较小差异（Brown, 2005）。
现有几个宏基因组组装软件，分别是Meta-IDBA（Peng等，2011）、MetaVelvet（Namiki等，2012）、metaSPAdes（Nurk等，2017）和Ray Meta（Boisvert等，2012）。
Meta-Velvet和Meta-IDBA能够利用k-mer覆盖分割de brujin图，区分不同菌株的读取，分别组装每个子图。
Ray Meta不解构de Brujin图，而是使用启发式引导图遍历方法来找到最佳组装。
不同组装软件得到的结果可以用Bambus2来组成框架图（Koren等，2011），通过检测重复和基因组变体来避免远缘微生物之间的错误连接。
单细胞测序基因组的组装能够避免这些由宏基因组测序导致的困难。但是，不均衡的序列覆盖、受污染的DNA和嵌合体也带来了新的组装挑战。
除了以上提到的方法，还有几种单细胞基因组组装的特定软件，比如Velvet-SC（Chitsaz等，2011），EULER+Velvet-SC（Chitsaz等，2011），IDBA-UD（Peng等，2012）和SPAdes（Bankevich等，2012）。
它们都使用了de Brujin图，并适用于不均衡的序列覆盖度。
Velvet-SC通过融合被大部分现有组装程序丢弃的低覆盖序列，优化了流行的开源组装程序Velvet（Zerbino和Birney，2008）。
Velvet-SC没有过滤低覆盖重叠群，而是将它们融合进更大的重叠群中，并重新计算它们的平均覆盖率。
E+V-SC是一个与Velvet-SC结合使用的软件，带有纠错程序EULER（Chaisson和Pevzner，2008），在单细胞基因组组装方面有更好的表现。
IDBA-UD使用多个深度阈值，同时在低深度和高深度区域移除错误的k-mers，并且执行纠错步骤以校正高深度区域的读取，加速组装过程。
SPAdes在E+V-SC的基础上进行了优化，不仅可以处理非均匀覆盖，还可以去除嵌合体。
另外，SPAdes还进一步避免了仅根据覆盖范围做组装决策，而是保留了被其它组装软件丢弃的低覆盖区域。
尽管以上提到的单细胞基因组合成软件也能进行宏基因组组装，近期研究表明，同时使用宏基因组和单细胞基因组的联合组装，能够显著改善组装结果的连续性和完整性。
比如单细胞DNA提取可能会导致染色体断裂或DNA损伤，导致一些基因组区域的的丢失（Rodrigue等，2009），而这个可以从宏基因组数据中恢复。
另一方面，单细胞基因组的读取可以为宏基因组组装提供线索。
比如，几项独立研究同时使用了单细胞基因组和宏基因组，从不同细菌群落中获得了更好的细菌基因组组装（Dupont等，2012；Blainey，2013；Nobu等，2015）。
近期，Becraft等利用一个候选门Calescamante（EM19）现有的单细胞基因组数据作为锚点来对校准一个多层感知机器学习算法，直接从其它样品的序列读取中生成宏基因组分箱（Becraft等，2015）。
对比基于组装的方法，物种分箱和基于读取的机器学习方法能够产生更完整的最终组装产物。
Ji等人使用流式细胞术从原始样品中获得了处理过的微型宏基因组，并利用原始宏基因组的补充，从处理过的微宏基因组中回收到高质量的基因组（Ji等，2017），这极大地提高了新微生物基因组的质量和数量。
又或者，Yu等人使用微流体并行技术将环境样品分为几个含5-10个细胞的亚样品，然后他们使用每个亚样品中基因组同时出现的信息来提高宏基因组组装（Yu等，2017）。
总的来说，宏基因组学和单细胞基因组学的结合代表了环境中未培养微生物组装的新方向。
宏基因组组装产物中的物种聚类
宏基因组学研究中的一个主要的问题是把宏基因组组装产物明确到或分箱到菌种或菌株水平上。
通常情况下有两个方法，基于物种依赖性分类（有监督）和物种非依赖性分类（无监督）。
物种依赖性分类基于序列比对、进化模型和/或寡核苷酸模式。
物种非依赖性分类则完全基于序列组成、丰度、标记基因、时间序列丰度概况或它们的任意组合，从重叠子中提取特征来推断分箱（Wu等，2014；Kang等，2015；Lin和Liao，2016）。
然而，这些无监督方法含低丰度菌种的样品中效果不佳。
MetaCluster5.0通过从低丰度读取中分离高丰度菌种读取和两轮的分箱方法解决了这个问题（Wang等，2012）。
因为对缺乏宏基因组进行有监督分类所需的参考基因组，无监督方法是宏基因组分箱的首选方法。
最近，单细胞基因组学正成为有监督分类中重要的锚点（Becraft等，2015），对比传统的分箱方法，该方法极大地提高了最终分箱结果的完整性。
微生物基因组的物种和功能注释
SSU rRNA基因被广泛用来确定环境样品中某些细菌的进化位置（Wu等，2009；Zaneveld等，2010）。
但是，基因水平转移可能会偶尔模糊结果（Ochman等，2000）。
比如，现已发现几个进化距离远的SSU rRNA基因在进化树中紧密排列在一起（Woese等，1991；Hasegawa和Hoshimoto，1993）。
因此，从单个SSU rRNA基因进行的微生物进化推断，应该结合其它的进化标记予以证实，比如与功能基因相结合。
在进行系统发育分析时，多个普遍且广泛存在的单拷贝基因比单个SSU rRNA基因效果更好，因为在遇到随机错误时，这些进化信号的共同反应结果强于比单个基因的反应结果。
最后，单细胞宏基因组学的重要使命是通过鉴定蛋白编码基因、注释基因功能和重建代谢途径来认识它们的生理和代谢特点。
GLIMMER（Delcher等，1999；Delcher等，2007）是广泛用来从完整的细菌基因组中鉴定编码基因的工具。
标注步骤依赖于如KEGG、COG、EggNOG、NR等公共信息库进行同源比对。
近期，又出现了几种综合性方法（Overbeek等，2014；Seemann，2014；Page等，2015），它们为细菌基因组注释提供了更高效的一站式软件。
单细胞宏基因组学在病毒-宿主互作研究中的应用
病毒-宿主互作是自然环境中的常见过程，包括感染、共生和捕食，其可动态改变宿主的演化、多样性和代谢潜能，并最终影响这种相互作用的功能（De Smet等，2017）。
传统上，病毒-宿主互作的研究主要基于实验室实验，使用纯培养或利用宏基因组方法进行非间接分析（Wang等，2016）。
但是，大部分微生物不可培养的现实限制了这种病毒-宿主互作的研究模式，并且类似地，宏基因组学并不能明确鉴定个体的病毒-宿主对。
单细胞基因组学因其无需培养的特点，能够同时恢复细菌细胞中的核苷酸序列以及多余的染色体基因原件，因此极大地促进了不可培养和只限特定细胞的病毒-宿主互作的研究。
通过这个方法，Yoon等人从不可培养的Picozoan原生生物中发现了一个新的极微小病毒，并获取了其全基因组序列（Yoon等，2011）。
另一项研究中，通过分析不可培养的g-变形菌门中SUP09 的127个单扩增基因组（SAGs），Roux等发现了有三分之一的细胞感染了有尾噬菌体目（Caudovirales; dsDNA）或微小噬菌体科（ssDNA）的噬菌体（Roux等，2014）。
类似地，Labonte等人运用单细胞测序同时分析了细菌和古生菌细胞，并在关联的原生环境中分析了病毒基因信息（Labonte等，2015）。
他们发现，在58个系统发育和地理上不同的海洋细菌和古生菌的单扩增基因组（SAGs）中，有20个可以鉴定出病毒，并且至少有4个噬菌体-宿主的互作具备晚期裂解性感染的特点。
这个研究证明了将单细胞基因组学与基于序列的计算机技术相结合，可以使得人们可以从原位和不依赖于培养的角度认识复杂微生物群落中的宿主-病毒互作。
Martinez-Garcia等将SAG和微阵列结合，确认了病毒和普遍存在的超噬热盐纳古菌门间的互作（Martinez-Garcia等，2014）。
Avital等人使用scDual-Seq技术分析胞内病原体鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和鼠巨噬细胞间的互作，其中宿主巨噬细胞的单细胞RNA以及正在感染该巨噬细胞的细菌被同时测序（Avital等，2017）。
他们发现了3个被感染的巨噬细胞的亚群，这些亚群支持一种模型，即这三种状态和感染的三个连续阶段相吻合，因此他们认为这是一个连续过程。
Munson-McGee等人将单细胞测序和环境宏基因组学相结合，探索黄石国家公园一个热泉微生物群体中的病毒-宿主互作（Munson-McGee等，2018）。
他们发现多种专一型和普遍型的病毒在相对多样性水平较低的群体中共存。
超过60%的细胞含有至少一种病毒，大多含有两个或更多种类的病毒。
另一项研究将单病毒基因组学和病毒宏基因组学应用到了人唾液样品中，用于研究口腔的病毒群体结构（de la Cruz Pena等，2018）。
结果表明，唾液病毒可以被分为大约200个主要的病毒群体，大约与以种进行的分组相吻合。
这些研究表明了单细胞宏基因组学在探索不同群体中不可培养病毒的多样性和遗传信息的能力。
在微生物亚种比较研究中的应用
尽管已有一些方法可以从宏基因组中探索菌株水平上的多样性，但亚种间的差异很难通过宏基因组方法确定（Albanese和Donati，2017；Quince等，2017；Truong等，2017）。
单细胞基因组学能够帮助我们探索这些差异。
通过使用PCR程序确认细胞分选后的亚种，Kashtan将大规模的单细胞测序用于研究丰富的海洋蓝细菌原核绿藻（Prochlorococcus）（Kashtan等，2014）。
他们发现这些原核绿藻由上百个带有独特的“基因组骨架”的亚群组成，每个骨架由一组不同的核心等位基因与少部分特有的可变基因连接组成。
估计这些亚群已经分开进化至少几百万年了，这暗示了他们古老且稳定的环境区分。
如此大量共存的亚群可能是非寄生型菌种的共同特点，它们在高度异质性的栖息地中大量存在（Kashtan等，2014）。
结论
单细胞基因组和宏基因组学或宏转录组学能够极大地改善我们对病毒-宿主互作、亚种多样性和不可培养细菌基因表达的理解。
此外，它们能够在空间和时间尺度上扩展我们对微生物和及其功能多样性的认识。
我们相信，在较长的一段时间内，单细胞基因组学与宏基因组学结合的好处是无法取代的。
随着新测序技术的发展（更长的读长和更高的通量）以及更好的细胞分选方法的发展，单细胞宏基因组学无疑将成为微生物组研究越来越重要的研究手段。
（翻译全文结束，参考文献请见pdf原文，下载地址：https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-018-0544-5 。）
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