撰文│徐海斌
编辑│毕紫娟
审校│汤红明
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【据《Science Advances》2023年8月报道】题：培养的自体角膜缘上皮细胞移植——制造工艺的发展及其可行性和安全性的临床评估（美国哈佛大学医学院丹娜法伯癌症研究院作者Jerome Ritz等）（）
研究团队成功开发了一种创新的用于治疗单侧角膜缘干细胞（limbal stem cell，LSC）缺陷的方法。该方法采用无异物、无血清、无抗生素的两步法制备自体培养的角膜上皮细胞（cultivated autologous limbal epithelial cell，CALEC）， 随后通过非侵入性扫描显微镜评估最终移植物的存活和无菌性。培养的细胞保持了上皮细胞的特征，具有形成集落和增殖的能力，并且保留了干性。研究团队进行了Ⅰ期临床试验，招募了5例患有单侧LSC缺陷的患者。其中4例患者接受了CALEC移植，未发生不良事件，初步证明了这种方法的可行性。基于这些结果，研究团队已开展了第2阶段的招募试验，以获取更多患者的长期安全及疗效数据。
研究团队首先用尸体的角膜活检样本制作了上皮细胞的单细胞悬浮液，培养在六孔板上，并在（9.1±2.5）天内形成了一层连续的P0细胞单层。将收获的P0细胞[（3.0～5.0）×104个] 种植在去上皮化的AmnioGraft上，在（6.7±1.4）天内形成了连续的单层细胞。在P0细胞培养过程中，细胞的平均存活率为（83.9%±11.6%），单个角膜的最佳细胞种植剂量为（4.0±1.0）×104个细胞。共聚焦显微镜观察显示，这些结构包含一层均匀的鹅卵石状细胞。进一步使用流式细胞术对P0阶段的角膜缘活检细胞进行鉴定。细胞高表达上皮标志物CD49和CD340，低表达白细胞/内皮细胞标志物CD45/CD31，以及间充质干细胞标志物CD13，确认培养的P0细胞主要呈上皮细胞表型。实验显示平均克隆形成效率（colony-forming efficiency，CFE）为（7.6%±2.7%）。为了确定P0扩增后细胞的增殖潜力，研究团队使用了一种功能性、定量化且标准化的方法测量细胞内腺苷酸三磷酸酯（intracellular adenosine
50-triphosphate，iATP），在7天内以3种不同的细胞浓度培养P0细胞，并测量了iATP。测量结果表明，培养的LSC增殖能力与剂量呈正相关。为了评估最终的CALEC（P1）中的细胞状态，使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）标记及活细胞/死细胞双染试剂盒进行原位增殖和存活度检测。结果显示（25.0%±2.0%）的细胞为EdU阳性细胞，83.0%±1.0%的细胞存活。这说明使用尸体的角膜缘活检制备的CALEC具有高存活率和增殖能力。研究团队进一步在人角膜缘组织中通过免疫荧光检测到了干细胞标志物p63、p63α和C/EBPδ的表达，而CALEC分化标志物角蛋白12（Krt12）主要出现在角膜和角膜缘的更表层细胞中。体外培养的P0阶段的细胞保持了这些干细胞标志物的表达，表明干性在细胞培养中得到保留。CALEC在荧光显微镜下也同样表达这些干细胞标志物。
为了确定CALEC的最佳转运方法，研究团队首先将CALEC在低温条件下（2～8℃，持续6天）进行培养和储存。发现细胞死亡率与上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）水平相关。这表明可通过检测上清液中LDH的含量来确定CALEC存活率。当CALEC在低温条件下保持时间长达72小时时，细胞存活率保持较高（死亡率低于10%）。通过比较在2～8℃储存和37℃恢复后新鲜CALEC上清液中的LDH水平，评估低温储存对组织保存液-HypoThermosol中CALEC存活能力的影响。HypoThermosol FRS中储存的CALEC上清液中具有较高的葡萄糖和较低的乳酸水平，这表明代谢不活跃，但CALEC再次置于37℃后，代谢活性从低温储存中恢复。基于这些结果，最终的CALEC在含有HypoThermosol FRS培养基中被转移，并通过带有温度和倾斜监测功能的可重复使用的EVO转运设备从cGMP实验室运送到手术室。EVO容器被设置为在运输过程中将CALEC保持在2～8 ℃范围内。
研究团队随后在4例受试者中进行了CALEC移植以评估CALEC治疗单侧角膜缘干细胞缺乏（limbal stem cell deficiency，LSCD）的安全性、可行性和初步疗效。在Ⅰ期临床测试中，角膜供体的眼睛在活检后均痊愈，没有并发症， 视力在4周内恢复到基线水平，并未发生重大安全事件（表1）。在CALEC移植物制备的同时，研究团队还制备了3个受试者的备份CALEC移植物。通过免疫组织化学检测这些备份移植物LSC标志物的表达。其中Krt12、p63、p63α和C/EBPδ的平均阳性率分别为2.9%、2.8%、4.3%和2.7%。
综上，研究的初步阶段已经证明了这种制造方法的可行性，并且不存在安全问题，为第二阶段试验的招募提供了保障。这项研究使用的活检方式对供者眼睛诱导LSCD的风险较低，并且该试验展示了CALEC制备及移植程序的可重复性。在初步12个月的安全性报告之后，研究团队将在更大患者队列中采集更多数据，包括严格定义的18个月随访有效性终点并将这些结果与自体产品的标记和效力检测数据进行相关性分析。如果成功，CALEC在美国的首次使用将成为确立细胞疗法产品作为LSCD患者治疗方案的重要里程碑。