Life Med | 李春义/顾颖等绘制异种器官存活与生长的单细胞图谱

生产异种器官有望为临床器官短缺和免疫排斥问题提供有效的解决方案。Rashid等人（2014）提议通过将人多潜能干细胞（pluripotent stem cells）植入到通过基因工程在大动物体内制造的“器官微环境”（囊胚）中，来生产异种器官。这种途径虽然有效，但人类细胞将可能参与这种人-动物嵌合体产生的配子和神经分化，因此存在着伦理担忧，且不说技术方面的挑战（Kobayashi and Hensch，2013）。因此，将干细胞或组织移植到动物体内（避开囊胚）伦理争议要小得多。要实现这个愿望，免疫缺陷动物的使用不可或缺。Oldani et al（2018）通过将大鼠肝细胞注射到免疫缺陷小鼠中来诱导异种肝脏生成，然后将诱导的肝脏再回移到大鼠体内，成功构建了嵌合肝脏；在免疫抑制的情况下，这些肝脏移植的大鼠存活了112天以上。Kaneko et al（2017）通过将猪睾丸组织移植到裸鼠体内获得了猪的功能性精子。但问题是通过这种途径生产异种器官的成功率很低，而导致成功率低的机制尚不清楚。在之前的研究中发现，将鹿茸干细胞组织（覆盖在青春期前鹿额外嵴上的骨膜）移植到裸鼠皮下，几乎100%形成异种鹿茸（Li et al，2009）。因此，为研究移植细胞/组织与宿主环境间的互作、启动异种器官构建，以及追溯异种器官中不同细胞的来源（移植物或宿主）提供了理想的模型。

鹿茸是哺乳动物中唯一能够每年周期性脱落和完全再生的骨质器官。研究揭示，鹿茸的发生和完全再生依赖于未来生茸区（额外脊）的骨膜。在鹿茸发生前剔除这个骨膜，鹿将永久失去发生鹿茸的能力。如果将这个骨膜移植到鹿体其他部位的皮下都能发起异位鹿茸的发生。令人吃惊的是，这个骨膜的移植能100%成功诱导裸鼠生长异种鹿茸。进一步的研究证明，生茸区骨膜细胞具有干细胞的属性，因此被称为鹿茸干细胞，鹿茸的再生被定性为一种干细胞依赖性割处再生。

2022年7月，长春科技学院李春义课题组与华大生命科学院顾颖课题组合作在Life Medicine杂志在线发表了题为Chimeric blood vessels sustained development of the xenogeneic antler: a unique model for xenogeneic organ generation的研究论文，从单细胞水平绘制了异种器官鹿茸的细胞图谱和不同种类细胞的物种来源，发现异种器官的生存和发育是宿主通过构建的嵌合血管网络所支撑的。

研究人员使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）的技术绘制了裸鼠异种鹿茸中细胞类型组成的图谱，以及不同细胞类型的物种来源（鹿或小鼠）；并探索了移植物（鹿组织）和宿主（裸鼠）不同种细胞间互作导致异种鹿茸形成的机制。收集移植骨膜手术后第14、21和35天（简称鹿鼠嵌合体 （DM）14、DM21和DM35）的异种鹿茸，并对这些组织进行了scRNA测序。在对不同组scRNA序列数据进行质量控制和整合后，总共获得了27167个细胞。通过标记基因鉴定了11种细胞类型，包括鹿茸干细胞（ASCs）、祖细胞、软骨细胞、壁细胞、干/壁样细胞、淋巴内皮细胞、血管内皮细胞（VECs）、单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞和自然杀伤细胞/T细胞以及造血干细胞（HSCs）。

研究人员进一步分析了DMs中不同种细胞的物种来源。结果表明，DMs主要由鹿源细胞（约90%）组成，在这些DMs的发育过程中，鹿源细胞和鼠源细胞的相对比例一直保持动态平衡。大多数细胞类型显示出物种来源的特征：骨系细胞（ASCs、祖细胞和软骨细胞）、干/壁样细胞、壁细胞和肥大细胞全部来源于鹿；单核细胞/巨噬细胞和自然杀伤细胞/T细胞主要来源于裸鼠。在DM14（即第14天）时存在鼠源HSC，并且发现这种鼠源HSC的比例在DM发育期间保持恒定。淋巴管内皮细胞所占比例相对较小，均来源于鹿。VECs来源于鹿和裸鼠两种动物，但鼠源VECs的比例随着DMs的生长而逐渐增加。用红色荧光裸鼠生长的异种鹿茸证明了这一发现。

进一步scRNA-seq的结果表明，免疫细胞主要来自鼠，而肥大细胞仅来自鹿。免疫荧光和流式细胞术分析表明，单核细胞/巨噬细胞都是鼠源。组织学染色显示，HSC不仅位于骨小梁区，而且位于皮下，它们都来自鼠。令人惊讶的是，DMs中的HSC数量非常高，远远高于外周血，甚至高于骨髓（Sutherland et al，1994；de Wynter et al，1999）。组织学染色显示肥大细胞分布在整个异种鹿茸组织中，它们都来源于鹿。

重建血液循环对于移植组织/器官的生存和发育至关重要。scRNA-seq的结果表明，VECs主要来源于鼠，而壁细胞和干/壁样细胞只来源于鹿。VECs在异种鹿茸早期阶段（DM14）同时来源于鹿和鼠。然而到DM35阶段，VECs主要来源于鼠。相反，壁细胞和干/壁样细胞仅来源于鹿，这一现象在DMs的发育过程中没有改变。红色荧光裸鼠异种鹿茸组织的免疫荧光染色证实，壁细胞（SMA⁺）来源于鹿，VECs（CD31⁺）主要来源于鼠。

为了探索裸鼠血管内皮细胞如何参与构建了连接鹿茸干细胞组织和宿主的血管网络，研究人员使用CellphoneDB生信软件分析了血管内皮细胞与鹿源细胞之间的互作机制。结果表明，与鹿茸干细胞组织在鹿本身的发育相比，DMs组织中细胞间的互作更加广泛，鼠VECs和鹿ASCs/壁细胞/祖细胞/软骨细胞之间存在强烈的相互作用。同时发现，GO富集的互作细胞对主要涉及血管生成、细胞增殖和迁移等。在鹿细胞和鼠血管内皮细胞之间确定了调节血管生成的经典互作对（Klagsbrun and Moses，1999），即VEGF-FLT、VEGF-KDR、IGF-IGFR NRP-SEMA。发现鹿ASCs及其分化细胞群表达高水平的CCL2，推测是招募鼠内皮细胞的关键因素。

前人的研究表明，壁细胞可由多种细胞分化而来，包括血管平滑肌细胞、血管内皮细胞的转分化、外膜成纤维细胞和循环系统中的干细胞（Owens et al，2004）。重点研究了DMs中壁细胞的来源，并进行了拟时序轨迹分析，包括ASCs、祖细胞、软骨细胞和干/壁样细胞。结果表明，干细胞分化成两个分支，分别是壁样细胞和软骨细胞。免疫组化染色表明，不仅血管周围的细胞表达α-SMA，许多分散在组织中的细胞也表达α-SMA。Clark et al（2006）发现，鹿茸前软骨区（非血管）的一些细胞呈α-SMA阳性，并提出这是生长鹿茸中血管形成和生长的主要区域。实验证明，ASCs当与C2C12（肌肉祖细胞）共同培养时，这些细胞可以分化成肌肉样细胞。同时，通过EdU标记方法证明壁细胞可以在DM中增殖。因此，DMs中的血管壁细胞很可能来自鹿茸干细胞组织本身的分化和增殖。这样，鹿源血管壁细胞和鼠源VECs共同形成鹿-鼠嵌合血管，维持异种鹿茸的生存和发育。

血管生成因子是启动血管生成、促进血管细胞组装和血管成熟的重要因素（Nomi et al，2002）。鹿茸干细胞组织本身分泌多种血管生成因子，如VEGF、S100A4、TMSB10（Zhang et al，2018）和PTN（Dong et al，2021）和CCL2。这些因子很可能是刺激宿主内皮细胞向移植物生长血管（主要是壁细胞）迁移的诱导因子，从而形成了嵌合血管。无论移植物的性质是什么，移植后都要有一个短暂的时间窗口机会，在这个时间窗内，宿主血管必须向移植的组织器官供血，以避免由于缺血导致损伤和坏死（Eckstein，2010）。

总的来说，研究人员建立了一种构建异种器官的独特模型，这个模型在研究移植物和宿主细胞之间的互作和不同物种细胞来源方面具有显著的优势。通过scRNA-seq绘制了异种鹿茸中不同细胞类型组成的图谱，并确立了图谱中不同种类细胞的来源（鹿或小鼠）。最终发现，鹿源细胞在异种鹿茸中占绝对主导地位，宿主是通过鹿-鼠嵌合血管支撑了整个异种鹿茸的生长发育。此外，研究人员还成功地将异种器官（鹿茸）回移到了同一供体（鹿），发现回移的器官不但能完全存活，而且还比移植时的体积大了三倍多。总之，嵌合血管可能是移植物与宿主快速建立循环网络的最佳途径。在临床上为了促进移植物-宿主间的嵌合血管的快速生成，在移植物中应该引入特定类型的血管细胞、促血管生成因子和/或各种基质材料。

参考文献：

Clark, DE, Li, C, Wang, W, Martin, SK, and Suttie, JM (2006) Vascular localization and proliferation in the growing tip of the deer antler. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 288: 973-981.

de Wynter, EA, Emmerson, AJ, and Testa, NG (1999) Properties of peripheral blood and cord blood stem cells. Baillieres Best Pract Res Clin Haematol 12: 1-17.

Eckstein, HH (2010) Langenbeck's Archives and the early development of vascular surgery in Germany. Langenbecks Arch Surg 395 Suppl 1: 33-36.

Kaneko, H, Kikuchi, K, Nakai, M, Fuchimoto, D, Suzuki, S, Sembon, S, Noguchi, J, and Onishi, A (2017) Establishment of a strain of haemophilia-A pigs by xenografting of foetal testicular tissue from neonatally moribund cloned pigs. Sci Rep 7: 17026.

Klagsbrun, M, and Moses, MA (1999) Molecular angiogenesis. Chem Biol 6: 217-224.

Li, C, Gao, X, Yang, F, Martin, SK, Haines, SR, Deng, X, Schofield, J, and Stanton, JA (2009) Development of a nude mouse model for the study of antlerogenesis--mechanism of tissue interactions and ossification pathway. J Exp Zool B Mol Dev Evol 312: 118-135.

Oldani, G, Peloso, A, Vijgen, S, Wilson, EM, Slits, F, Gex, Q, Morel, P, Delaune, V, Orci, LA, Yamaguchi, T, et al. (2018) Chimeric liver transplantation reveals interspecific graft remodelling. J Hepatol 69: 1025-1036.

Owens, GK, Kumar, MS, and Wamhoff, BR (2004) Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev 84: 767-801.

Rashid, T, Kobayashi, T, and Nakauchi, H (2014) Revisiting the flight of Icarus: making human organs from PSCs with large animal chimeras. Cell Stem Cell 15: 406-409.

Sutherland, DR, Keating, A, Nayar, R, Anania, S, and Stewart, AK (1994) Sensitive detection and enumeration of CD34+ cells in peripheral and cord blood by flow cytometry. Exp Hematol 22: 1003-1010.

原文链接：https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnac021

作者简介

李春义

长春科技学院

李春义，博士，长春科技学院教授，长科鹿茸研究所所长，吉林省鹿茸生物学重点实验室主任，吉林省鹿茸工程研究中心主任，吉林省干细胞学会副理事长。博士毕业于新西兰Otago大学医学院，从事鹿茸研究近40年。发表SCI论文120余篇、著作四部。获“中国青年科技奖”，省“科学技术进步二等奖”（3项，均为第一），“国家科技进步二等奖”（第三名），省自然科学一等奖（第一名）。多次在国际大会主旨演讲。指导博士生12人，硕士生50余人。

制版：陆小炮

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