免疫检查点阻断（ICB）疗法通过激活免疫系统来抑制肿瘤的发生和转移，已成为一种极具前景的治疗策略。在众多的检查点中，程序性死亡配体1（PD-L1）被认为是肿瘤相关免疫抑制和肿瘤进展的关键调节因子，已被用作临床治疗实体肿瘤的治疗靶点。目前，常用单克隆抗体或小干扰RNA（siRNA）来阻断PD-L1/PD-1通路，但存在耐久性差、免疫反应低等问题。因此，永久性、特异性地抑制肿瘤细胞中PD-L1基因的表达，有望实现更有效、更持久ICB治疗。
作为一种前沿的基因组编辑工具，聚类规则穿插短回文重复序列（CRISPR）-相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统为癌症的治疗提供了新的思路。CRISPR/Cas9具有精确高效的基因编辑能力，能够在sgRNA的引导下识别特定的DNA序列，并通过Cas9核酸内切酶切割目标PD-L1基因，调控肿瘤细胞PD-L1的表达。在肿瘤治疗中，基于质粒的CRISPR/Cas9系统因其结构简单、成本低、整合效率高而被广泛应用。提高靶标特异性和基因编辑效率是CRISPR/Cas9系统在免疫治疗中的关键，因此迫切需要开发靶向肿瘤和响应性的纳米载体，以精确和有效地在肿瘤细胞内传递CRISPR/Cas9质粒。
东华大学郭睿教授/史向阳教授课题组构建了一种双响应的负载Au纳米颗粒核壳结构树状大分子纳米平台（Au CSTDs），用于有效压缩和响应性释放“切除PD-L1基因的CRISPR/Cas9质粒”（Cas9-PD-L1），实现肿瘤靶向的高效、持久的ICB治疗（图1）。研究团队首先以包裹金纳米颗粒、乳酸（LA）修饰的第五代聚酰胺-胺树状大分子为核心，以连接苯硼酸（PBA）的第三代树状大分子为外壳，通过LA和PBA形成苯硼酸酯键构建了pH/ROS响应的负载金纳米颗粒的核壳树状大分子Au CSTDs。通过其表面PBA与肿瘤细胞中过表达的唾液酸结合完成特异性的肿瘤传递，并在肿瘤弱酸性和高ROS下解离，实现Cas9-PD-L1的响应性释放和有效转染、敲除肿瘤细胞的PD-L1基因，实现持久高效的ICB免疫治疗。其中，金纳米颗粒在提高基因转染效率的同时，可以实现CT成像可视化追踪。
图1. (Au0)25-G5-LA/PBA-G3（Au CSTDs）的合成方案及基于ICB癌症免疫治疗的CRISPR/Cas9传递机制研究团队通过1H NMR、UV-vis和2D NOESY证明了金纳米颗粒的成功包裹以及核壳树状大分子的成功构建（图2A-C）。TEM、AFM以及水合粒径分布图显示出Au CSTDs呈球形，且大小均一（图2D-F）。Au CSTDs的红细胞溶血率低于5%，具有良好的血液相容性。此外，通过荧光光谱分析验证了苯硼酸酯键在低pH和高H2O2的响应性断裂，这将导致Au CSTDs在肿瘤微环境下发生pH和H2O2响应性分解（图2H和I）。
图2. (A) (Au0)25-G5-LA、G3-PBA和Au CSTDs的1H NMR谱。(B) G5-LA、(Au0)25-G5-LA和Au CSTDs的紫外-可见光谱。(C) Au CSTDs的2D NOESY光谱。(D) Au CSTDs的TEM图像和大小分布直方图。(E)AFM图像和Au CSTDs的高度轮廓。(F)各物质在水中的水合粒径图。(G)不同浓度的Au CSTDs对小鼠的溶血率。阳性对照为1%的Triton X-100 (TX-100)，阴性对照为PBS。插图显示了与材料共孵育2小时离心后的照片。(H) Au CSTDs在pH为7.4、6.4和5.4时的荧光激发光谱。(I) Au CSTDs在含H2O2 (0.1 mM) pH = 7.4的荧光激发光谱。所有激发光谱均使用388 nm的发射波长。PBA的浓度固定在1 mM。研究团队构建了CRISPR/Cas9质粒系统，其中包含了sg RNA、Cas9蛋白以及增强型绿色荧光蛋白的DNA序列，用于后续的实验（图3A）。琼脂糖凝胶阻滞实验表明，当N/P为1时材料可将质粒完全压缩（图2B），将载体/质粒复合物置于低pH和H2O2存在条件下，Au CSTDs可以响应断裂且释放出质粒（图2C）。图2D验证高N/P条件下，纳米复合物在肿瘤微环境条件下水合粒径明显增大，结构变得松散，利于质粒的释放。因此，Au CSTDs可以作为载体来压缩和响应性释放CRISPR/Cas9质粒系统。随后，研究团队进行了细胞实验，CCK-8实验证明材料具有良好的细胞相容性（图2E），绿色荧光蛋白转染实验表明，核壳结构可以有效转染质粒，并且最佳N/P为15（图2F和G）。
图3. (A) Cas9-PD-L1质粒和靶向PD-L1的sgRNA序列。(B)不同N/P比下， Au CSTDs压缩Cas9-PD-L1质粒的琼脂糖凝胶阻滞试验。1：DNA Marker (5000 bp)；2：游离Cas9-PD-L1；3−8：N/P比分别为0.125、0.25、0.5、1、2和5。(C) N/P = 10时，在不同环境下Au CSTDs压缩Cas9-PD-L1质粒的琼脂糖凝胶阻滞试验。(D)不同N/P比下Vector/Cas9-PD-L1的水合粒径。(E)不同载体浓度的Vector、Vector/Cas9-PD-L1和Vector/ Cas9-NC处理的B16-F10细胞24小时的活力测定。Cas9-NC质粒中的sgRNA被无序DNA取代。(F)在N/P分别为2、5、10、15、20和30时，PBS、Cas9-PD-L1和Vector/Cas9-PD-L1转染B16-F10细胞后的代表性流式细胞仪图和(G)相对平均荧光强度。接下来，研究团队探索了Au CSTDs靶向传递的细胞内机制。细胞吞噬实验表明，PBA可以靶向肿瘤表面的唾液酸，并且细胞对复合物的摄取量随时间延长而增多（图4A）。溶酶体逃逸实验表明，加入复合物两小时后材料进入细胞，四小时后基因可进入溶酶体，八小时后基因从溶酶体出来，并有进入细胞核的趋势（图4B和C）。针对含金、响应、靶向三种特性，团队构建对照材料后进行了绿色荧光转染实验，结果显示双响应的Au CSTDs/Cas9-PD-L1系统由于肿瘤细胞的特异性摄取、响应性基因释放和强烈的内体逃逸，展现出更高的基因转染效率。
图4. (A) B16-F10细胞对Vector/Cas9-PD-L1在不同时间的细胞摄取。PBA作为阻断剂：加入Vector/Cas9-PD-L1前10分钟，用游离的PBA（4 mM）处理B16-F10细胞。(B)用Cy3标记的Cas9-PD-L1与Au CSTDs复合后处理2、4和8小时时，B16-F10细胞的共聚焦显微图像和相应的共定位荧光强度剖面分析以及(C) Cy3（红色荧光）和溶酶体（绿色荧光）之间的共定位率。细胞核用Hoechst 33342染色。溶酶体用LysoTracker绿色染色。比例尺:20 μm。PBS、nCSTD（非靶向非响应）、PBA + Au CSTDs（非靶向有响应）、Au CSTDs（有靶向有响应）和CSTD（不含纳米金颗粒）分别压缩Cas9-PD-L1质粒后，与B16-F10细胞孵育4 h后的(D)相对平均荧光强度与(E)荧光图像。PBA作为阻断剂。比例尺：100 μm。研究团队进一步验证了Au CSTDs递送CRISPR-Cas9系统的作用机制。T7核酸内切酶I证实了该系统有效的基因编辑能力，它可以在DNA水平上显著降低PD-L1基因。值得注意的是，用Au CSTDs作为载体递送系统，比游离Cas9-PD-L1的对照组基因编辑效率增加了7.1倍（图5A）。RT-PCR以及WB实验证明，CRISPR-Cas9系统可以进一步降低PD-L1基因的RNA水平以及蛋白质水平（图5B和C）。
图5. (A) PD-L1基因组位点的T7EI检测，(B) PD-L1基因表达的RT-PCR检测，(C) PBS、Cas9-PD-L1、Vector/Cas9-PD-L1和Vector /Cas9-NC转染后PD-L1蛋白表达的WB检测。在(B)和(C)中，PBS处理的细胞表达量设为1.0。考虑到Au纳米颗粒具有良好的X射线衰减特性，研究团队对Au CSTDs的CT成像性能进行评价。与临床造影剂碘海醇相比，Au CSTDs具有更好的X-线衰减能力（图6A）。随后，研究团队建立了B16-F10肿瘤模型研究Au CSTDs在体内的积累和分布。结果显示，注射材料1小时后，Au在肿瘤及各器官中的含量达到峰值，随后逐渐被代谢出体外（图6B-D）。
图6. (A)不同浓度的Au CSTDs和碘海醇中Au或I的的CT图像和HU值。(B) B16-F10肿瘤模型瘤周注射Au CSTDs（[Au] = 5 mM）后，不同时间间隔的CT图像和HU值。肿瘤区域用红色圈出。(D)瘤周注射Au CSTDs后，小鼠主要器官和肿瘤在不同时间的Au含量的生物分布。团队研究评价了Au CSTDs/Cas9-PD-L1对B16-F10荷瘤小鼠的ICB治疗效果。经过治疗，相对于PBS组和载体/Cas9-NC组，Anti-PD-L1组和载体/Cas9-PD-L1组的肿瘤生长受到了一定的抑制，且载体/Cas9-PD-L1的抗肿瘤效果最好，且组间的小鼠体重变化较小（图7A-D）。HE、TUNEL和ki-67染色结果显示，治疗组可以促进肿瘤组织的坏死和凋亡，并且抑制肿瘤细胞的生长（图7E和F）。
图7. (A)体内肿瘤免疫治疗的示意图及时间轴。小鼠的(B)相对肿瘤体积变化、(C)分离肿瘤的照片和重量以及(D)不同治疗组的体重变化。每组6只小鼠。(E)第12天B16-F10肿瘤组织的H&E、TUNEL和Ki-67染色图片。比例尺：50 μm。(F)肿瘤切片中TUNEL阳性细胞和Ki-67阳性细胞的百分比。最后，团队探究了载体/Cas9-PD-L1抑制肿瘤的机制。WB实验和免疫荧光图片显示出，载体/Cas9-PD-L1组以及Anti-PD-L1组肿瘤部位PD-L1蛋白的表达显著下降，以及浸润的CD4+和CD8+ T细胞的增加（图8A和B）。并且，两组均可引起脾脏部位CD4+和CD8+ T细胞的表达增加、Tregs细胞的表达下降（图8C-F）以及血清中细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌上升（图8G-I所示）。
图8. (A)肿瘤组织中PD-L1蛋白表达的图像和定量分析。PBS处理的肿瘤组织中PD-L1的表达设置为1.0。(B)肿瘤组织中PD-L1蛋白、CD4和CD8 T细胞的免疫荧光染色。比例尺：50 μm。脾脏中T细胞的流式细胞术分析。(C) CD4+/CD8+ T细胞和CD4+CD25+FOXP3+ T细胞（Tregs）的点图。(D) CD4+和(E) CD8+ T细胞的比例和(F) Tregs的比例。(G)第12天血清中TNF- α、(H) IFN-γ和(I) IL-6的定量分析。简言之，研究团队设计的pH和H2O2敏感的Au CSTD纳米材料可以压缩和响应性释放CRISPR/Cas9质粒，通过永久性和特异性地破坏肿瘤细胞中PD-L1的表达，实现ICB治疗。Au CSTDs/Cas9-PD-L1通过靶向过表达唾液酸被肿瘤细胞特异性摄取，随着苯硼酸酯键的断裂Cas9-PD-L1被响应性释放出来，并定位于细胞核有效地切割PD-L1基因。体内实验证明，Au CSTDs/Cas9-PD-L1系统可以特异性聚集于肿瘤实现增强的CT成像，显著降低肿瘤细胞的PD-L1表达、诱导CD4+/CD8+ T细胞分布增加、减少免疫抑制细胞比例、上调细胞因子TNF-α/IFN-γ/IL-6，表现出显著的肿瘤抑制效果。因此，本研究制备的Au CSTD纳米材料为递送CRISPR/Cas9质粒用于ICB治疗提供了新的思路。以上研究成果以“Dual-Responsive Core−Shell Tecto Dendrimers Enable Efficient Gene Editing of Cancer Cells to Boost Immune Checkpoint Blockade Therapy”为题，发表于国际著名期刊ACS Applied Materials & Interfaces（2023, 15, 12809-12821）。东华大学生物与医学工程学院郭睿教授和史向阳教授为通讯作者，硕士研究生刘俊洁为第一作者。该工作得到了国家自然科学基金、上海市人才发展基金、上海市科学技术委员会等项目的资助。
文章链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.2c22584
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