ACMG遗传变异分类标准与指南（3）| 全外专题

ACMG 制定的标准与指南作为教育资源旨在帮助临床遗传学家提供优质的临床检验服务。本文将与大家分享《中国科学: 生命科学》杂志中的“遗传变异分类标准与指南”一文，将分成7个章节与大家一起学习，今天的内容是指南的序列变异解读的拟定标准介绍，一起来看看吧~

3.  序列变异解读的拟定标准

以下评估变异证据的方法是用了解释在临床诊断实验室中具有疑似遗传(主要指孟德尔遗传)疾病患者的变异. 并不适用于解读体细胞变异、药物基因组(PGx)变异、或者是多基因非孟德尔复杂疾病相关的基因变异. 在外显子组或基因组研究中, 对候选基 因(意义不明确的基因(GUS))应用这些准则时应当谨慎(见下面注意事项), 因为本指南目的不是满足鉴定新致病基因的研究需求.

虽然这些方法可用于评估在健康个体中发现的变异或与测试指征不相关的变异,  但是正如在指南的几个部分中所述,  对于与指征无关的有较低先验致病性的变异时需更加谨慎. 尽管期望本指南适用于变异分类,  无论其是通过分析单基因、基因包、外显子组、基因组或者转录组而鉴定的,  重要的是要关注与疾病有关的致病变异和虽然预测为对蛋白有破坏/损伤但却与疾病无充分关联的变异之间的区别.这些规则旨在确定在孟德尔遗传病中有明确作用的基因的变异是否对该遗传疾病是致病的.  针对具体的病人, 致病性判定应该独立于对疾病病因的解读. 例如, 某变异在一个案例中被评估为“致病的”,  而在另一个案例中,  由于不能解释该疾病,  就对这个位点不给出“致病的”评价, 这样的情况是绝对不允许的. 确定致病性需要将全部的证据汇集在一起,  包括所有的案例分析,  最终得出一个结论.

此指南的分类方法可能比目前实验室应用的标准更为严格.  这将导致很大一部分的变异被归类为“意义不明确的”. 希望这种方法可以大量减少那些没有足够分类证据支持而报告为致病原因的变异 . 需要注意的是, 当临床实验室报告一个变异为“致病 的”时, 医疗单位很可能把其当作“可指导临床作为 的(actionable)”, 基于这个判断, 从而会改变对患者的治疗、监测，或去除对基因型为阴性的家庭成员的治疗、监测(参见下面的医务工作者应该如何使用 这些指南和建议).

本指南提供了两套标准:  一是用于对致病或可能致病的变异进行分类(表 3),  另一是用于对良性或可能良性的变异进行分类(表 4). 致病变异标准可分为非常强(very  strong,  PVS1),  强(strong, PS1~4);  中等 (moderate,  PM1~6),  或辅助证据 (s upport i ng, PP1~5).  良性变异证据可分为独立(stand-alone,  BA1), 强(strong, BS1~4), 或辅助证据(BP1~6). 其中, 数字只是作为有助于参考的分类标注, 不具有任何意义. 每个类别中的数字不表示分类的任何差异, 仅用来标记以帮助指代不同的规则. 对于一个给定的变异, 用户基于观察到的证据来选择标准. 根据表5的评分规则把标准组合起来进而从5级系统中选择一个分类. 这些规则适用于变异上的所有可用数据, 无论是基于调查现有案例获得的数据, 还是来源于先前公布的数据. 未发表的数据也可以通过公共数据库(如 ClinVar 或位点特异数据库)和实验室自有数据库获得. 为了对变异分类具有较好灵活性, 基于收集的证据和专业判断, 可以把某些依据用到不同的证据水平上去.  例如,  如果一个变异多次和已知致病性变异处于反式位置(位于另一染色体上), PM3 可以上调到强(进一步指导见PM3 BP2顺/反式检测). 相反, 在数 据并不像描述的那么强的情况下, 可以改判变异到一个较低的水平(见表3注2 PS4). 如果一个变异不符合分类标准(致病的或良性的), 或良性和致病的证据是相互矛盾的, 则默认该变异为“意义不确定的”. 程度判断评价标准如表6所示. 请注意, 当考虑所有 依据以解读变异证据强度的差异时, 需专家介入进行判断.

下面更详细的变异分类标准(表3和4)中提及了某些概念的解释, 并提供实际使用中的实例和/或误区或易犯错误的地方. 这部分应该与表3及4一同阅读.

3.1 PVS1极强致病性变异

某些特定类型的变异(如无义突变、移码突变、经典剪接位点±1或2点突变、起始密码子变异、单个或多个外显子缺失)被认为因无转录产物或由无义突变引起的转录子降解, 导致基因产物完全缺失而破坏基因功能. 当将这类变异归类为致病性时, 从业人员需谨慎考虑以下原则:

(i) 当将该类变异归类为致病性时, 需确认无功能变异(null variants)是已知的致病机理, 且与该疾病的遗传模式相一致. 例如, 有些基因(如许多肥厚性心肌病基因)只有杂合错义突变时才致病, 而杂合无功能变异却是良性的. 仅基于这一项证据来看, 对显性肥厚性心肌病来说, MYH7基因上出现一个新的杂合无义突变不一定是致病的, 而 CFTR 基因上出现一个新的杂合无义突变则有可能是一个隐性致病变异.

(ii) 当文献中将 3′远端下游截短变异注释成致病突变时, 要特别小心. 特别是当所预测的终止密码子出现在最后一个外显子, 或者出现在倒数第二个外显子的最后50个碱基对时, 这种无义突变介导的转录降解可能不会发生,  这个蛋白很可能会表达.据此所预测的截短蛋白的长度也是致病性评估的因素,  但这些变异未经功能分析是无法进行判定的. 

 (iii) 就剪接位点变异而言,  因外显子剪切位点的供体/受体位点改变或产生了新的剪切位点,  从而可能导致外显子丢失、缩短, 也可能会使内含子序列变成外显子部分. 虽然剪切位点变异可能被预测为无功能变异, 然而该变异类型造成的影响需要通过 RNA 或蛋白质功能分析确认. 还必须考虑可读框内缺失/插入的可能性, 其长度变化较小(PM4),可以保留蛋白质的关键结构域, 因此导致轻微或中性效应, 或功能获得效应.

(iv)  基因会有不同的转录本, 哪一种转录本与生物学功能相关, 在哪些组织会表达哪些转录本, 这些都是需要进行重点考虑的. 如果一个截短变异只限于一个或并非所有转录本, 则必须谨慎考虑到可能存在其他同功型蛋白质,  防止过度解释.

(v)  如果发现一个无功能变异位于某个外显子上,  而该外显子先前无致病变异报道,  那么该外显子可能被选择性剪切了,  此时需要谨慎考虑该变异的致病性. 当预测的截短变异是偶然发现时(与检测指征无关)则应特别小心, 在这种情况下该位点致病的可能性非常低.

3.2  PS1突变为同一氨基酸

多数情况下, 尤其是当致病机制是蛋白质功能发生改变时, 如已确定某一错义变异是致病变异, 应考虑到与其位于同一变异位点的不同形式的碱基改变也可能产生相同的错义突变结果——氨基酸改变相同(如c.34G>C(p.Val12Leu)和c.34G>T(p.Val12Leu)), 那么, 这些变异也应是致病突变. 此外, 还应考虑到, 变异可能不是通过改变氨基酸的水平, 而是通过改变DNA的序列来发挥作用, 例如, 破坏剪接 位点(可通过软件分析确定), 在这种情况下, 上述的假设是不成立的.

3.3  PS2 PM6新发变异

当将一个新发变异(父母样本检测结果阴性)归类为强的致病证据时, 需要满足以下条件: (i) 身份检验表明患者的父母是其生物学父母. 注意如果父母的身份是假定的而没有被证实, 则判定为PM6; (ii) 患者的家族史符合新发变异特征.  例如,  显性遗传病患者的父母均未患病. 在存在生殖细胞嵌合现象时也可能有1个以上同胞患病; (iii) 患者的表型与变异基因异常引起的表型相吻合. 例如, 患者具有特殊面容、多毛和上肢缺陷(即 Cornelia de Lange 综合征), 检测到NIPBL基因的新生突变即为强致病证据, 而患者仅表现为非特异性的发育迟缓, 通过外显子组测序发现的该基因的新发变异, 则判断此变异致病性的证据较弱.

3.4  PS3 BS3功能研究

功能实验研究是一种研究变异致病性的非常强大的工具, 然而并非所有的功能研究都能有效地预测基因或蛋白的功能. 例如, 一些酶学实验利用成熟 完善的方法可以用来评估错义变异在代谢途径中对酶活性的影响(如 α-半乳糖苷酶功能实验); 而另一方 面, 某些功能实验在评估变异对蛋白质功能的影响时缺乏一致性. 评估一个功能检测方法是否有效时, 必须考虑该功能实验在多大程度上反映了其发挥功能的生物环境. 例如, 与体外表达蛋白相比, 直接在患者或动物模型的活检组织中进行酶的功能实验更有说服力. 同样, 可以反映蛋白质全部生物学功能 (如酶分解底物功能)的实验则比仅反映一部分功能 (如一种有附带结合能力的蛋白水解 ATP 的功能)的实验证据性更强. 功能实验的有效性、重复性和稳定性应重点考虑, 这些参数用来评估功能实验的分析 性能以及判定样本诊断信息的完整性, 该完整性容易受标本采集的方法及时间 、存储及运输的影响 . CLIA(临床实验室改进修正案)认证实验室建立的检测方法或商品化试剂盒可减少这些因素对实验的影响. 评估变异在剪接位点、编码序列、非翻译区以及 更深的内含子区域的影响时, 对变异在信使RNA水平(如信使 RNA 的稳定性、加工或翻译)进行评估, 可以提供丰富的信息. 相关的技术方法包括对 RNA 和/ 或互补DNA 衍生物进行直接分析, 以及体外微小基因剪接分析.

3.5  PS4 PM2 BA1 BS1 BS2 变异频率及对照人群的使用

通过搜 索公共人群 数据库(如千人基因组数据 库, NHLBI 外显子测序数据库, EXAC 数据库; 表 1), 并利用已发表文献中相同种族的对照数据进行基因变异频率分析(译者注: 此条款在指南更新时会有修改), 通过分析变异基因在对照人群或普通人群中的携带频率, 有助于评估该变异的潜在致病性. NHLBI 外显子测序数据库来源于白种人和非裔美国人群 , 根据其数据覆盖量能够识别是否存在基因变异. 尽管千人基因组数据库缺乏评估基因变异能力, 但它囊括了更多的种族人群, 因此其数据具有更广泛代表性的. EXAC数据库近期发布了一组来源于不同人群的6万多个外显子组的等位基因频率数据, 包括了大约三分之二的 NHLBI 外显子测序数据. 一般情况下, 某一等位基因在对照人群的频率大于疾病预期人群(表 7)时, 可认为是罕见孟德尔疾病良性变异的 强证据(BS1), 如果频率超过 5%时, 则可认为是良性变异的独立证据(BA1). 此外, 如果疾病发生在早期, 且变异在健康成人中以隐性(纯合子)、显性(杂合子) 或X-连锁(半合子)的状态存在, 那么这就是良性变异的强证据(BS2). 如果数据库中未能检出变异的存在, 应该确认建立该数据库采用的测序读长深度是否足以检测出该位点上的变异.  如果在一个大样本的普通人群或队列数据的对照人群(>1000 人)中变异不存在(或隐性遗传的突变频率是低频), 并且携带此变异的患者与对照人群为同一种族, 那么可以认为该变异是致病性的中等证据(PM2). 许多良性变异是“个体化的”(即个人或家系独有的), 因此即使在相同种族的人群中缺乏也不能作为致病性的充足甚至强的证据.

当孟德尔遗传病表型显著、频率差异大且是早期发病时,  使用通过“病例－对照”人群研究获得的变异数据库进行变异分析是最有效的. 临床实验室检测的患者可能包括“排除”某一疾病的个体,  因此他们可能不能作为表型显著的病例; 当使用普通人群作为对照群体时,  具有亚临床疾病的个体总是可能存在的. 在这两种情况下, 认为检测出的变异致病性证据不充分.  变异频率有统计学显著差异可以假定为致病性的支持证据.  与此相反,  对于统计差异不显著, 特别是极为罕见变异和不明显的表型, 应谨慎 解释.

比值比(OR)或相对风险用于衡量基因型(即存在于基因组中的变异)和表型(即所患疾病/结果)之间的关联,  适用于任何孟德尔疾病或复杂疾病.  本指南只涉及其在孟德尔疾病中的使用.  相对风险与OR不同,  但概率较小时相对风险近似等于OR.  OR值为1.0 意味着该变异与疾病风险不相关, 大于 1.0 意味着变异与疾病风险正相关, 小于 1.0 意味着变异与疾病风险负相关.  一般情况下,  具有孟德尔中等效应的变异, 其OR 值为 3 或者更大, 高度外显的变异具有非常高的 OR 值,  例如,  APOE 基因 E4/E4 纯合子与E3/E3 纯合子相比, OR值为 13(https://www.tgen.org/ home/education-outreach/past-summer-interns/2012-summer-interns/Erika-kollitz.aspx#.VOSi3C7G_vY)。OR值的置信区间(confidence interval, CI)也是一个重要的衡量工具. 如果 CI 中包括1.0(如 OR=2.5, CI= 0.9~7.4), 则关联的可信度很小. 在上面APOE的例子中,CI为10~16. 在线可获得简单的OR值计算器(http://www.hutchon.net/ConfidOR.htm/;http://easyca-lculateon.com/statistics/odds-ratio.php/).

本文整理自《中国科学: 生命科学》杂志，侵删

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