在纳米医学领域，纳米材料已被开发和证实可以用于肿瘤免疫治疗，包括改变肿瘤微环境将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，以及合理重塑免疫微环境以产生强大的免疫应答，例如，通过使用化疗、光热治疗、光动力治疗等策略诱导癌细胞产生免疫原性细胞死亡（ICD）。ICD可以增强树突细胞的抗原递呈、T细胞的激活，从而增加对实体瘤的免疫刺激和破坏免疫抑制效应。常规疗法与ICD的结合，为抗肿瘤治疗提供了新的途径和研究方向。然而，ICD触发的肿瘤微环境（TME）重塑只能提供次优的癌症免疫治疗结果，容易造成第二次的肿瘤免疫逃逸。最重要的是，尽管患者体内存在大量新抗原，但由于未能获得充分和持久的抗肿瘤免疫应答，基本上难以实现肿瘤的完全治愈。这主要是由于树突细胞（DCs）存在免疫逃逸效应，限制其有效抗原呈递能力，导致ICD效应无法从根本上影响淋巴结中的DCs和T细胞的活化。那么如何促进抗原递呈细胞（APC）的抗原递呈能力，触发原位肿瘤抗原释放，以增强免疫原性和抗肿瘤免疫响应，是开发有效纳米药物用于免疫治疗的关键。
有研究表明，DCs中的YTHDF1蛋白是实现增强肿瘤免疫治疗的潜在治疗靶点之一，YTHDF1蛋白（RNA m6A甲基化的重要读取器蛋白）涉及DCs相关的抗肿瘤免疫过程，其下调可有效增强DCs的肿瘤抗原交叉呈递能力，限制DCs的免疫逃逸效应，进一步提高细胞毒性T细胞在肿瘤部位的浸润并改善抗肿瘤免疫。因此，通过设计巧妙的纳米平台，一方面利用纳米平台实现化疗及化疗相关的ICD效应，增强免疫效应，另一方面增强DCs抗原递呈能力，打破免疫逃逸瓶颈，可实现协同的癌症免疫治疗，这无疑为扩大和加强免疫治疗提供了新思路。
在研究团队前期工作中，已经证明金刚烷（Ad）修饰的第三代（G3）聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子和β-环糊精（β-CD）修饰的第五代（G5）PAMAM树状大分子之间可以通过主客体识别，自组装形成G5-CD/Ad-G3核壳结构树状大分子（CSTDs）。合成的CSTDs显示出比单独G5更高的基因转染效率、药物上载率以及增强的钆配合物r1弛豫率和基于增强渗透滞留（EPR）效应的被动靶向，现已成功应用于乳腺癌细胞的基因、化疗的联合治疗和弛豫率及EPR效应双重增强的肿瘤磁共振成像（J. Mater. Chem. B 2020, 8, 2768-2774，Biomacromolecules 2021, 22, 2181-2188）。此外，壳层分子G3-Ad还可作为独立模块分别修饰吡啶、皮啡肽和RGD肽，经过主客体识别G5-CD自组装形成多功能CSTDs，乙酰化并络合铜离子合成多功能CSTD-铜络合物后，通过皮啡肽与μ-阿片受体结合跨越BBB，利用RGD靶向脑胶质瘤，运用铜离子的r1弛豫性能和发生类芬顿反应的能力，实施原位脑胶质瘤的磁共振成像和化学动力学治疗（Nano Today 2021, 41, 101325）。然而，目前还没有报道涉及使用CSTD负载药物进行化疗-免疫治疗，也没有递送功能性基因对DCs进行改造，从而改善肿瘤的免疫治疗。
基于此，东华大学史向阳教授团队采用“双管齐下”的方式，构建了两个基于CSTD的纳米模块，用于乳腺癌细胞和树突细胞的程序化治疗，即通过肿瘤化疗、化疗诱导的ICD效应和DCs的正向调节，对乳腺癌实施增强的化学免疫治疗（图1）。一方面，合成乙酰化G5/G3 CSTDs以封装DOX，形成G5.NHAc/G3.NHAc/DOX（G5-G3-D）复合物作为纳米模块，用于化疗并产生ICD。另一方面，用甘露糖（Man）和两性离子羧基甜菜碱（CBAA）修饰的CBAA-G5/G3-Man以递送YTHDF1 siRNA到DCs，用于刺激DCs的成熟，并增加DCs的抗原递呈能力，从而实现增强的乳腺癌化学-免疫治疗。
图1. 基于CSTDs的双纳米模块的制备和作用示意图。研究团队首先通过AFM表征了G5.NHAc/G3.NHAc和CBAA-G5/G3-Man的形貌和高度，这两种CSTDs均显示半球形，高度分别为11.8 ± 0.32 nm（图2A-B）和5.7 ± 0.50 nm（图2C-D）。BSA吸附试验证明了CBAA的修饰使CBAA-G5/G3-Man具有抗蛋白吸附性能（图2E）。480 nm处DOX的特征吸收峰的出现证明了G5-G3-D纳米药物的成功制备（图2F），AFM显示了G5-G3-D形貌和高度（14.4 ± 0.53nm）（图2G-H），DOX的体外释放动力学实验表明G5-G3-D复合物更易在酸性环境下释放（图2I）。而琼脂糖凝胶阻滞试验证明了CBAA-G5/G3-Man在氮磷比N/P比≥1时可以完全压缩YTHDF1 siRNA形成CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物（图2J），并且在一定N/P条件下，CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物的流体动力学尺寸稳定在160-176 nm（图2K），表面电势稳定在32-37mV（图2L）。
图2. CSTDs和基于CSTDs的纳米模块的表征。G5.NHAc/G3.NHAc（A，B）和CBAA-G5/G3-Man（C，D）的AFM图；（E）CBAA-G5/G3-Man的抗蛋白吸附试验图；（F）基于DOX的各材料紫外吸收曲线；（G, H）G5-G3-D复合物的AFM图；（I）不同pH条件下，G5-G3-D复合物中DOX体外释放动力学研究图；（J）不同N/P比下，CBAA-G5/G3-Man压缩YTHDF1 siRNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物在不同N/P比条件下的流体动力学尺寸（K）和ζ电位（L）。随后，研究团队在体外研究了G5-G3-D复合物纳米模块的化疗效果和引发的ICD效应。MTT实验证明了G5-G3-D复合物对小鼠乳腺癌4T1细胞的抑制作用（图3A）。流式细胞术检测了G5-G3-D复合物对4T1细胞凋亡的影响（图3B）。此外，通过Transwell实验证明，G5-G3-D复合物可引起4T1细胞CRT外翻（图3C），刺激HMGB-1释放（图3D），从而在体外诱导4T1细胞发生免疫原性死亡，刺激树突细胞熟化（图3E-F）。
图3. G5-G3-D复合物纳米模块的体外化疗效果和ICD效应。（A）不同材料处理后的4T1细胞活力图；（B）不同浓度的G5-G3-D复合物处理后4T1细胞的凋亡情况统计图；各组材料与4T1细胞共孵育后，（C）CRT的表达，（D）HMGB-1的释放，各组材料刺激DCs熟化的流式统计图（E）和流式分析图（F）。团队在体外研究了CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物纳米模块对目的基因YTHDF1的沉默效率和刺激DCs成熟效率。首先，团队确定了CBAA-G5/G3-Man压缩YTHDF1 siRNA被细胞吞噬的最佳N/P比为15，并用共聚焦显微镜观察了Cy3标记的YTHDF1 siRNA在树突细胞中的定位，进一步证实了CBAA-G5/G3-Man可以递送YTHDF1-siRNA被DCs有效内化（图4A）。Man阻断实验证明了修饰Man后，CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物对DCs具有更高的亲和力（图4B-C）。WB实验证明，CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物可以降低目的基因YTHDF1的蛋白质水平，沉默效率为44%（图4D）。此外，通过流式细胞术证明了CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物可引起DCs的熟化（图4E-F）和增强DCs抗原递呈能力。
图4. CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物纳米模块的基因转染效果和DC成熟评估。（A）不同材料处理DCs 4小时后的共聚焦显微镜图像；（B, C）不同条件（有无Man阻断）下，CBAA-G5/G3-Man/Cy3-YTHDF1siRNA复合物处理4小时后，DCs的吞噬效率；（D）基于WB测定的蛋白质表达图像和定量分析图：1-4分别代表PBS、CBAA-G5/G3-Man、游离YTHDF1 siRNA和CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物；分别用PBS（I）、游离YTHDF1 siRNA（II）、CBAA-G5/G3-Man/ NC siRNA（III）和CBAA-G5/K3-Man/YTHDF1 siRNA（IV）处理DCs 24小时后，刺激DCs熟化的流式统计图（E）和流式分析图（F）接下来，研究团队在小鼠体内构建了原位乳腺癌（4T1）模型，探索了两种基于CSTDs的纳米模块用于小鼠原位乳腺癌模型的体内化学-免疫治疗。图5A为具体治疗方案。图5B展示了在治疗期间，除游离DOX组会导致轻微的体重减轻外，所有其他组的小鼠体重都略有增加，这表明除游离DOX外，各个治疗方法的生物毒性可以忽略不计。如图5C-D所示，治疗结束后肿瘤体积的大小顺序为PBS 组> CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA组 > 游离DOX.HCl组 > G5-G3-D组> DOX.HCl + CBAA-G5/G3/G3 Man/ YTHDF1 siRNA组 > G5-G3-D + CBAA-C5/G3 Man/YTHDF1 siRNA组，并且G5-G3-D + CBAA-G5/G3 Man/YTHDF1 siRNA治疗组与DOX.HCl + CBAA-G5/G3/G3 Man/YTHDF1 siRNA组（V，p≤0.01）和G5-G3-D（III，p≤0.001）之间存在显著差异，这表明G5-G3-D和CBAA-G5-G5/G3 Man/YTHDF1 siRNA两个纳米模块的组合导致了最显著的肿瘤生长抑制。此外，各组的TUNEL和H&E染色结果（图5E）也表明G5-G3-D + CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA治疗组导致了最高水平的凋亡和坏死肿瘤细胞群，这与肿瘤体积数据一致。
图5. 体内抗肿瘤效果。（A）两种基于CSTDs的纳米模块：G5-G3-D复合物与CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物组合的处理方案图。治疗期间小鼠体重变化图（B）、相对肿瘤体积变化统计图（C）和代表性肿瘤图片（D）。（E）治疗15天后小鼠肿瘤部位的TUNEL和H&E染色图。对于（B-F）：Ⅰ代表PBS；Ⅱ代表游离DOX；Ⅲ代表G5-G3-D；Ⅳ代表CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA；V代表游离DOX + CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA；VI代表G5-G3-D + CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA。随后，研究团队进一步探索评估了G5-G3-D复合物纳米模块联合CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物纳米模块介导的化学免疫治疗机制。研究发现在治疗15天后，G5-G3-D + CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA治疗组的肿瘤部位具有最显著的CRT表达（图6A），血清中免疫相关细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的含量也远高于其他组（图6B-D），脾脏中CD4+和CD8+T细胞的细胞群体较其他组别也最显著（图6E-G）。
图6.体内免疫反应。不同组治疗后15天肿瘤切片中CRT的免疫荧光染色（A）和血清中细胞因子TNF-α（B）、IFN-γ（C）和IL-6（D）水平以及脾脏中CD4+和CD8+T细胞的流式细胞术测定数据（E-G）。对于（A-G）：Ⅰ代表PBS；Ⅱ代表游离DOX；Ⅲ代表G5-G3-D；Ⅳ代表CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA；V代表游离DOX + CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA；VI代表G5-G3-D + CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA。简而言之，该研究基于CSTDs设计的双纳米模块充分利用了CSTDs相对于单代树枝状大分子在改善药物负载、放大肿瘤穿透/EPR效应和提高基因递送效率方面的优势，具有以下特点：1）G5-G3-D复合物作为其中一个纳米模块用于肿瘤的化疗，同时用于ICD诱导使DCs成熟；2）CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合作为另一个纳米模件，通过对DCs中YTHDF1表达的基因沉默来刺激DCs成熟，增强其抗原递呈能力；3）这两大纳米模块通过对癌细胞和DCs的程序化治疗以协同增强T细胞介导的肿瘤免疫治疗，从而实现了对小鼠原位乳腺癌模型的增强型化学免疫治疗。本研究制备的CSTDs双纳米模块为协同调节T细胞以实现增强的抗肿瘤化学免疫治疗提供了新思路。以上研究成果以“Core-shell tecto dendrimer-mediated cooperative chemoimmunotherapy of breast cancer”为题，在线发表于国际著名期刊Journal of Controlled Release (DOI: 10.1016/j.jconrel.2023.05.021)。东华大学生物与医学工程学院史向阳教授和沈明武研究员为共同通讯作者，博士毕业生宋聪为第一作者（现为山东第一医科大学副研究员），博士研究生詹梦偲为共同第一作者。该工作得到了国家自然科学基金委、上海市科委及上海市领军人才计划等项目的资助。
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https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.05.021
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