▎药明康德内容团队编辑
在我们的传统印象中，“大”和“强”总是不分家，但在今天的基因编辑领域中，“大”却成了令研究者烦恼的减分项，“小”才是新目标。本周，继知名学者张锋教授的团队发表了小型Cas13基因编辑系统后，又有3篇来自中国、韩国、美国的小型CRISPR/Cas研究“组团”上线，频频改写“最小”记录。这3项研究分别发表在9月2日的《自然-化学生物学》《自然-生物技术》和9月3日的《细胞-分子细胞》上。
▲两天内三篇论文聚焦小型CRISPR/Cas基因编辑系统的开发
为什么众多研究者会将目光聚焦到CRISPR的小型化？这本质上是由运送CRISPR工具进入动物体的“货车”——病毒载体决定的。目前最常用且最成熟的病毒载体之一是AAV病毒，它的容量大概是4.7 kb。传统的Cas9、Cas12a等核酸酶虽然具有良好的编辑功能，但它们的分子尺寸相比之下都太大了！大到无法直接装进AAV病毒里，或者只能放下Cas蛋白的部分，没法同时携带其他的重要部件，就限制了这些系统在基因治疗等领域的应用。人们目前还无法找到能替代AAV病毒的新“货车”，那么比“换车”更容易实现的方案就是“换货”——寻找那些更小型的能够编辑哺乳动物细胞的CRISPR系统。因此，很多团队开始致力于挖掘和测试更迷你的Cas蛋白，力争做到“没有最小，只有更小”。
本周上线的这3项研究都围绕Cas12f家族的小型核酸酶展开，这个家族的Cas蛋白普遍都展现出了“迷你”的气质，尺寸仅在400~700个氨基酸左右，比经典的Cas9要小一半甚至更多。这就可以为AAV腾出更多空间，好让基因编辑工具能带更多“装备”上阵。韩国科学技术大学Yong-Sam Kim 教授的团队和美国斯坦福大学亓磊（Lei S. Qi）教授的团队都聚焦于Un1Cas12f1。这个蛋白最早在2018年由诺奖得主Doudna教授的团队报道，大小为529个氨基酸。当年Doudna教授在研究中没发现这个蛋白能在体内切割双链DNA，因此觉得它不能开发出基因编辑工具。但之后的研究表明，它只是自身存在一些结构缺陷，和RNA、DNA的结合力都很弱，回炉“改造”一下没准还能上。所以，这两个团队在Doudna教授的研究基础上，从不同的角度出发，对原有的系统进行了升级改造。亓教授团队主要优化了蛋白的氨基酸组成，增强和核酸的互作；而Kim教授则是精简优化了sgRNA。经过不同的操作，最终都让Un1Cas12f1系统实现了体内的基因编辑功能。上海科技大学季泉江教授领衔的团队研究了另一种新的Cas12f家族蛋白——AsCas12f1，这是一种嗜热细菌（Acidibacillus sulfuroxidans）来源的核酸酶，大小仅为422个氨基酸，比Un1Cas12f1还要更小。这个蛋白最初由立陶宛的一个研究团队在2020年初鉴定，当时发现它能在体外切割DNA，而体内活性不明。季泉江团队鉴定了AsCas12f1的PAM序列识别特征（5’-TTR），以及这个蛋白发挥活性所必须的RNA组件。
▲CRISPR核酸酶AsCas12f1切割DNA的机制（图片来源：参考资料[4]）他们还发现，AsCas12f1有独特的分子机制，能在DNA双链上切割3次（靶向链1次，非靶向链2次），产生不对称的粘性DNA末端，而其他的Cas蛋白大多是切割2次。“这种不对称切割的特征，可用来连接一些经过设计的特殊序列。”季教授指出。此外，天然状态下未经“魔改”的AsCas12f1，就能在细菌和哺乳动物细胞中完成高效的基因编辑功能。这些“迷你版”CRISPR核酸酶的鉴定和研究，将为分子生物学、生物医学研究和临床治疗等领域提供更多精巧的新工具。[1] Zhaowei Wu et al., (2021) Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease. Nature Chemical Biology Doi: https://doi.org/10.1038/s41589-021-00868-6 [2] Do Yon Kim et al., (2021) Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus. Nature Biotechnology. https://doi.org/10.1038/s41587-021-01009-z[3] Xiaoshu Xu et al.,（2021）Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Molecular Cell Doi: 10.1016/j.molcel.2021.08.008[4] 物质学院季泉江课题组开发极小型CRISPR-Cas12f基因编辑工具 Retrieved Sep. 3, 2021 from https://www.shanghaitech.edu.cn/2021/0903/c1001a72245/page.htm
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