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文章简介
人类体内和植物根系都存在着数量庞大种类繁多的微生物群落（微生物组）。肠道微生物组随人类年龄的演化规律关系到人们的健康。与之类似，植物根系微生物组随植物生长的变化规律对植物健康也非常重要，与农作物营养高效利用、连作、轮作等重要问题密切相关。
日前，隶属于中国科学院遗传与发育生物学研究所，植物基因组学国家重点实验室，中国科学院-英国约翰英纳斯中心植物和微生物科学联合研究中心(CEPAMS)的白洋课题组与合作者详细描述了水稻田间全生育期根系微生物组的变化规律。研究人员对典型品种在两个地点进行了全生育期田间每周连续采样（图A），检测了446个水稻根系样品的微生物组。结果显示根系微生物组随水稻的生长时间和发育期逐渐变化，进入水稻的生殖生长期之后开始稳定（图B）。
通过机器学习领域的随机森林算法，鉴定了23类与水稻田间生长发育呈明显变化规律的根系代表性细菌（图C），这些细菌种类在根中的丰度与水稻在田间的生长时间呈现明显的变化规律（图D）。该成果说明农作物的生长时期是益生菌在农业上的施用过程中需要考虑的重要因素。把农作物生殖生长期需要的益生菌在幼苗期施用，效果自然不好。该成果将为水稻根系益生菌的施用提供理论支撑。
以上成果于3月23日在线发表于《Science China Life Sciences》杂志上，白洋组博士后张婧赢、博士生张娜和工程师刘永鑫为共同第一作者，华大基因的金桃、中国科学院遗传与发育生物学研究所的储成才研究员和白洋研究员为共同通讯作者。该工作得到中国科学院战略性先导科技专项（B类），国家自然科学基金面上项目和中国科学院前沿科学重点研究项目的支持。
文章于6月被选为《中国科学生命科学》封面文章正式见刊。
文章链接：http://engine.scichina.com/publisher/scp/journal/SCLS/doi/10.1007/s11427-018-9284-4
Zhang, J., Zhang, N., Liu, Y.X., Zhang, X., Hu, B., Qin, Y., Xu, H., Wang, H., Guo, X., Qian, J., et al. (2018). Root microbiota shift in rice correlates with resident time in the field and developmental stage. Sci China Life Sci 61, https://doi.org/10.1007/s11427-018-9284-4
图表解读与绘制
本文的4个主图，共分为5篇文章进行了可重复计算的R语言代码独立讲解，并提供了全部R代码、实验数据，方便同行学习，以及实现可重复计算。
你只需安装R语言运行环境和运行所有的包，配合Rstudio软件，点击Run逐行运行即可重现本篇文章中的所有分析和图片绘制。
将来你有类似的分析需求，只需准备你自己的数据作为输入文件，简单修改代码中自己的实验设计相关信息，即可完成分析与绘图。
1. 水稻根系微生物随时间变化吗？
实验设计与群落整体结构(主坐标轴PCoA)分析
图1. 田间水稻微生物组随生育时间变化
A. 水稻全生育期根系微生物组实验设计模式图(以水稻日本晴和IR24为材料,并分别种植于昌平和上庄两地，CP代表北京昌平农场，SZ代表北京海淀上庄)
B-C. 主坐标轴分析(PCoA)展示水稻微生物组随时间变化，其中微生物群落结构主要在第1/2轴上随时间变化(B)，而不同土壤类型主要在第3轴上明显分开(C)
方法说明：图1A采用Aodbe Illustrator手绘，封面也是AI绘制，生物AI插图素材获取和拼装指导。
图1B/C是基于Bray-Curtis距离进行的PCoA分析，采用散点图展示，并按时间顺序填充彩虹色，按不同compartment设置形状。图1B展示PCo1/2轴，组间最大差异为不同compartment与时间梯度上的变化。图1C展示PCo1/3轴，可进一步看到1轴的差异与时间变化一致，而3轴可以很好分开不同地点。
绘制模式图，工具有非常多的选择。有的大神用PPT可以画出美到极致的模式图，有的人用喜欢用PS。在这里我们推荐用AI，因为它是学术界矢量图绘制排版神器，没有之一。当然也有喜欢使用Coreldraw的朋友，它们的功能是类似的。
AI是Adobe Illustrator软件的缩写，对于各种软件生成的矢量图，混合编辑，轻松满足各类杂志的所有要求。没有基础的小伙伴可以学习下文：
本文中是用AI绘制了水稻不同生育期的矢量图，绘制还是要求有一定基础和思路，以及AI的基本使用技巧才能完成。
这里推荐来自youbute上使用AI绘制花和蝴蝶的教程，https://www.youtube.com/watch?v=WSxemBP-gZQ ，youtube最大的好处是有自动语音识别的字幕，反正我是感觉有字幕才不会错过细节(听太差，没办法，看美剧无需自幕的朋友别礼我，让我哭会)。无法访问外页的可以访问腾讯我上传的备用链接 https://v.qq.com/x/page/i0633druhc2.html ，访问不受限但也无字幕。
个人感觉软件操作比较容易学习，难点是如何设计合理的模式图，及基本的绘图技术。设计、构思、修改都是极花时间的，只有原作者对自己的项目理解最深刻，最容易构思较好的模式图，具体的绘制建议拿草图找会画画的同学/同事合作。生信宝典也提供对外模式图绘制业务，欢迎洽谈。
主坐标轴分析需要两个输入文件，一个是实验设计，即样本与分组(时间)对应表。另一个是样本间的距离矩阵(距离矩阵可通过OTUs直接计算获得，详见《扩增子分析流程》中第6节。也可以使用在线绘图工具高颜值可定制在线绘图工具-第三版完成。
关于本文中PCoA图统计绘图的详细代码与讲解，请点击如下链接：
2. 微生物组随时间变化的规律
图2. 田间水稻根系微生物组在8-10周趋于稳定。
A-D. 对两个水稻品种分别在两地进行的连续微生物组调查结果相关分析，发现8-10周后群落结构趋于稳定。
E. 所有时间点距离水稻最后取样点的Bray-Curtis距离。发现土壤呈同举目小幅波动变化，而根系呈现出先快后慢，逐渐趋近的变化规律。
F. 不同水稻品种在两个地点间的距离变化，发现土壤差异稳定，而根系微生物组差异随时间增长而趋于一致。
方法简介：A-D采用R的cor()函数计算pearson相关系数，并使用Corrplot包展示，时间轴使用pheatmap绘制热图展示。
E-F基于vegan包计算的所有样品两两间Bray-Curtis距离。分别挑选距离终点的距离，和两地间的距离与时间序列上的关系，并采用ggplot2可视化散点图，并添加拟合曲线方便观察变化规律。
相关分析和线性回归的教程，可访问如下链接：
关于相关分析、散点图拟合的详细代码与讲解，请点击如下链接：
3. 哪些菌门随时间呈现规律变化呢?
图3. 水稻根系微生物组主要菌门随时间变化(其中变形菌门丰度过高，进一步分为四个主要的纲)。图中6个子图分别展示了两个地点的土壤及两个品种的微生物组随时间规律的变化。
方法简介：此图主要使用R包ggaluvial绘制冲击图，时间轴采用pheatmap绘制热图。
时间序列分析中，流图可以非常好展示研究对象随时间的变化，如连线堆叠图、冲击图、桑击图。之前我们对这几类图都有专题介绍，如下：
下面链接是本文单中绘图的可重复代码详细教程 3-冲击图
哪些菌可以作为生育时间的biomarkers?
图4. 水稻生育期相关的微生物标记物(biomarkers)。
A. 采用随机森林方法在两地点的两品种样本中鉴定了23个纲与生育时间相关。其中按贡献度由大到小排序。其中的子图为交叉验证评估的结果。
B. 热图展示23个年龄相关的biomarkers相对丰度。
方法简介：本图A采用R语言的RandomForest包进行分析，结果采用ggplot2的柱状图进行可视化，biomarkers按贡献度由大到小排序，并进行交叉验证模型的准确度和biomarkers数量的选择依据。图B采用pheatmap展示每个时间点biomarkers的相对丰度均值，其中biomarkers按出现最高丰度的时间排序。
之前我们用了三篇文章，对随机森林的应用、分类、回归进行讲解和实战如下：
随机森林randomForest 分类Classification
随机森林randomForest 回归Regression
下面用我们学的知识(会运行R代码即可)，来实现随机森林回归的应用。
本分析的全部文件和代码，会在 https://github.com/YongxinLiu/RiceTimeCourse 上持续更新，也可以后台回复“时间序列”获得百度云下载链接。
如果本文分享的技术帮助了你的科研，欢迎引用下文，支持国产SCI越来越好。
Citition:
Zhang, J., Zhang, N., Liu, Y.X., Zhang, X., Hu, B., Qin, Y., Xu, H., Wang, H., Guo, X., Qian, J., et al. (2018). Root microbiota shift in rice correlates
with resident time in the field and developmental stage. Sci China Life Sci 61, https://doi.org/10.1007/s11427-018-9284-4
作者主讲的扩增子和宏基因组分析培训班也于9月和10月相继开班，欢迎一起加入。具体长按识别图中二维码。
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