查看原文
其他

深度好文--单碱基编辑技术之工具篇

生信宝典 2022-03-29

The following article is from 邦耀实验室 Author 张晓辉

  本文授权转载自“邦耀实验室”

前言



四个碱基A T C G 犹如一个个字符,它们排列组合形成的基因像一串串代码,在赋予生命个体共性的同时却又不失独特性,吸引着一个个学者前来探索生命的奥秘。并开发了多种工具展示这简单的四个碱基(感兴趣的请戳下面的历史文章):

随着生命科学技术的发展,基因编辑技术当仁不让地成为了研究者们的最强工具。如果说CRISPR/Cas9技术更改的是字符串,那么单碱基编辑技术更改的就是一个个精确的字符。如此巨大的突破,背后有哪些秘密呢?本期小编就带领大家一起研读单碱基编辑的进化论。


阅读本文前可以先看看我们之前整理的《CRISPR-CAS9发展历程小记》,大概了解下这个领域的重要事件。



单碱基基因编辑技术(base editors,BEs)


单碱基基因编辑技术,顾名思义,指能在基因组上引起单个碱基改变的基因编辑技术。基本原理是将胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)或腺苷脱氨酶与现存Cas9n(D10A)融合而形成,依赖于CRISPR原理使得靶点远离PAM端的4-7位的单个碱基发生修改的基因编辑技术。

 

目前的单碱基基因编辑包括两种


1. CBEs(Cytidine base editors)(图-1)[1]--嘧啶碱基转换技术(C/G到T/A)


图-1 CBEs工作示意图[1]


2. ABEs(Adenine base editors)(图-2)[2]-嘌呤碱基转换技术(A/T到G/C)


图-2 ABEs工作示意图[2]


相对于传统的CRISPR/Cas9的优势:


单碱基编辑技术工具的发展及优化历程


单碱基基因编辑技术自2016年4月被报道以来,迅速成为基因编辑技术领域的一颗璀璨的“明星”。其技术的发展核心主要是工具的不断优化。下面具体介绍:


第一类:嘧啶碱基转换工具-- CBE (Cytidine base editor)的优化历程


2016年4月: David Liu 实验室首先报道了基于来源于大鼠胞嘧啶脱氨酶与CRISPR/Cas9融合形成的单碱基基因编辑工具(Cytidine base editors, CBEs),包括BE1, BE2, BE3。其中在他们实验室报道的BE3(图-3),效率最高,也是目前应用的最为广泛的嘧啶碱基编辑工具,目前BE3已应用到基因编辑,基因治疗,动物模型制作及功能基因筛选等领域。


图-3. David Liu 实验室报道的BE3工具


2016年 8月:日本科学家 Keiji Nishida 等将来源于七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶与 CRISPR/Cas9和尿嘧啶糖苷酶抑制剂融合,该系统可在哺乳动物细胞中实现 15%-55%靶向突变[3]。


2016年 10月:常兴课题组将人源胞嘧啶脱氨酶融合 dCas9 的 C 端 (dCas9-AIDx)形成的TAM(targeted AID-mediated mutagenesis)可通过同样可在远离PAM的5-9位产生C到T,A,G的突变[4]。


2016年 11月:报道的 CRISPR-X(图-4),将来源于人的胞嘧啶脱氨酶突变体去除出核信号后融合到MS2蛋白上,通过 MS2 RNA 的发夹结构招募到sgRNA 的骨架中,经优化后的CRISPR-X, 可以引起+20到+40bp 窗口内实现平均20.6%的突变效率[5]。


图-4. CRISPR-X工作原理图[5]


2016年 11月:杨璐菡团队等将TALE, Zinc-finger DNA特异识别单元与来源于人的胞嘧啶脱氨酶进行融合,可在细菌和人的细胞中分别实现 13% 和 2.5%的 C 到 T 的突变效率[6],这可能是由于胞嘧啶脱氨酶的底物是单链DNA, 而 TALE和Zinc-finger 无法打开双链 DNA从无法使单链DNA暴露于胞嘧啶脱氨酶,影响了脱氨酶的效率,进而影响了C 到 T 的转换效率。


2017年1 月: 同时David Liu 实验室也在积极探索不受PAM限制的新型高效的单碱基因组编辑工具,如VQR-BE3(PAM: NGAN), SaKKH-BE3(NNNRRT)等。 同时,他们也通过胞嘧啶脱氨酶功能域进行氨基酸突变进而筛选到编辑窗口能精确到1-2碱基的单碱基工具,其中以YE1-BE3(W90Y+R126E)为最优,保持与BE3相似编辑活性的同时,将编辑窗口精确到1-2个碱基[7]。


2018年5 月:上海科技大学陈佳实验室将Cpf1与胞嘧啶脱氨酶进融合,由于Cpf1特殊结构,无法设计成切口靶向链而将非靶向链暴露于脱氨酶,因此,最初的Cpf1-Apobec1效率并不高,这一点与TALE-AID类似。但通过将核定位信号引入Cpf1-Apobec1改造为dCpf1-BEs (图-5)使其工作效率最高可达40%以上[8],因此,表明NLS的引入在单碱基基因编辑中有着至关重要的作用。


图-5 dCpf1-BEs工作原理图[8]


通过扩充PAM的CBE,将使CBE工具的使用更加灵活。 但由于CBE固有的原理,即胞嘧啶发生脱氨基时,随后将刺激细胞内的切除修复,因而在碱基编辑过程中不可避免的产生较低频的indels及非预期突变(C到G,A的突变),降低了其产物纯度。鉴于此,2017年8月, DavidLiu 实验室及陈佳实验室通过优化linker 及UGI的表达量,通过抑制内源尿嘧啶糖苷酶活性,得到BE4 和eBE-S3(图-6)均可以不同程度地降低indels及非预期突变,提高其产物纯度[9, 10]。


图-6. BE4 和eBE-S3


因引,经过科学家们对CBE工基础上进行了深入的挖掘和优化,目前的CBE已可以做到较高的编辑效率,较高的产物纯度,较精确的编辑窗口,较灵活PAM选择,这在精确碱基替换方面展示了无可替代的优势。


第二类:嘌呤碱基转换工具--ABEs(Adenine base editors)的优化历程


对于2017年10月报道的嘌呤转换工具-ABEs,它打破了过去单碱基编辑仅能编辑嘧啶碱基的限制。仅仅过去半年之多, 其已经在基因编辑,动物模型制作,基因治疗,植物的基因修饰等领域相续报道。 它的原理与CBE稍有不同,即腺嘌呤脱氨基之后为肌苷,在DNA水平被当作G进行读码复制,然而细胞内对于肌苷的切除修复并不敏感,因此,ABEs能够较为高效的产生A/T到G/C的突变,同时维持较高的产物纯度。


2018年2月: David  Liu 实验室,考虑到仅有PAM仍然是其使用的一个限制,后来David Liu实验室将Cas9通过PACE进化得到了不同氨基酸突变的xCas9 ,其中以xCas9 3.7最优, 它不仅NGG PAM与传统的Cas9保持相当的活性,而且可以,识别 NGA,NGC,NGT, GAA,GAT,同时保持较低的脱靶效应,这样可以靶向人类基因组范围内约的1/16的靶点。之后将其与ABEs 融合,也同样使ABEs PAM的选择也更加灵活[11]。


展望ABEs的发展,就是回首看CBE的发展。因此,对于ABEs来讲,更加灵活的PAM工具的开发,如 SaKKH(NNNRRT),Cpf1(TTTN) 的融合,也显得尤为必要。


2018年5月: 另外,最近David Liu实验室,在nature biotechnology报道通过密码子优化后的序列以及引入额外的核定位信号(双分型)的base editors, 得到BE4max 和ABEmax可以分别提高1.9倍,1.3-7.9倍的碱基编辑效率[13]。


2018年 7月:报道了BE-Plus (图-7),即将多个多肽GCN4与其抗体结合区分别融合Cas9n(D10A),Apobec1-UGI, 它可以募集多个拷贝的Apobec1-UGI的融合蛋白,这样可以在靶点区3-16位 C/G 到T/C的转变,可实现较大范围内单个碱基突变[12]。类比,将其运用到ABEs当中,也同样可以实现较大范围内A/T到G/C的突变。


图-7. BE-Plus的编辑窗口及编辑效率


2018年7月3日:来自nature biotechnology上最新报道, 也同样将密码子优化序列(图-9-1)及核定位序列引入(图-9-2)到单碱基中BE3中,以FNLS为例(图-8-3),用慢病毒在较为难转染的细胞中(如NIH3T3细胞)最高提高了约50倍的C到T 的突变(相对于BE3)(图-8-2),使应用更加广泛[14]。这些优化将促使单碱基基因编辑工具更加高效,灵活,通用。


图-8-1:RA:Lenti-BE3密码子优化

 

图-8-2 FNLS:RA的N端引入核定位序列

 

图-8-3  优化后不同Lenti-BE3 在NIH3T3细胞中不同的靶点编辑效率

 

单碱基编辑技术的应用


点突变是引起人类遗传病的主要原因之一。据 ClinVar database显示,C/G 到 T/A, A/T 到 G/C突变引起致病单核苷酸突变的分别占48%,14% (图-9)。


图-9人类遗传病中单碱基突变类型


也即是,这两种类型的突变将极大可能被ABE或CBE进行较正。因此,未来两种高效灵活的单碱基工具将会在未来的基因治疗中大显身手。如β-血红蛋白病,它主要由于在成年人中β-globin基因突变导致功能异常所致。目前已证实高水平表达胎儿血红蛋白(HbF)病被认为治疗β-血红蛋白病的很有潜力的策略[15]。-198 T > C[16], -175 T > C[17]这些在β-globin的启动区的突变可以通过不同的机制提高 HbF的表达。而这些突变已被报道可以被单碱基工具ABE7.10高效编辑[2, 13]。因此,未来利用单碱基治疗β-血红蛋白病(如地中海贫血)将极有可能是一个绝佳的策略。

 

虽然,CBE或ABE单碱基编辑技术具有其强大的优势,但是离未来临床疾病治疗仍然还有很多问题需要解决。


  1. 典型的CBE,ABE 高效编辑窗口依然是4-7位, 是否可将实现窗口平移,以靶向基因组更为广阔的空间也有待进一步研究;

  2. CBE可以通过突变胞嘧啶脱氨酶特定位点从而实现更加精确的1-2位的编辑窗口,而相对ABE的窗口最为精确也只能为4-7位,能否进一步通过突变腺嘌呤脱氨酶特定位点从而实现更加精确的ABE的编辑窗口,有待进一步研究。

  3. 在CBE,ABE中虽然均能高效地编辑某些靶点,但并非所有靶点均能编辑,其高效靶点是否存在某种规律?是否也Cas9中靶点的选择存在某种关系,也有待研究。

  4. 目前已经实现嘧啶与嘧啶,嘌呤与嘌呤之间互换,是否存在嘧啶与嘌呤之间的碱基互换,也有待进一步研究;

  5. 目前,Cas9蛋白结构已知,胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)或腺苷脱氨酶的蛋白结构也未知,融合成相应的CBE,ABE结构也未知,因此,未来解析CBE,ABE的融合蛋白结构深入理解单碱基编辑靶向识别与编辑机制,也意义重大。


更多“基因编辑干货”,请点击下方链接(持续更新中)


参考文献

[1] Komor AC, Kim YB, Packer MS, et al. Programmable editing of atarget base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016,533: 420

[2] Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, et al. Programmable base editing of a•t to g• c in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 2017, 551: 464

[3] Nishida K, Arazoe T, Yachie N, et al. Targeted nucleotide editingusing hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science, 2016,353: aaf8729

[4] Ma Y, Zhang J, Yin W, et al. Targeted aid-mediatedmutagenesis (tam) enables efficient genomic diversification in mammalian cells.Nature methods, 2016, 13: 1029

[5] Hess GT, Frésard L, Han K, et al. Directed evolution usingdcas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature methods, 2016,13: 1036

[6] Yang L, Briggs AW, Chew WL, et al. Engineering and optimisingdeaminase fusions for genome editing. Nature communications, 2016, 7: 13330

[7] Kim YB, Komor AC, Levy JM, et al. Increasing the genome-targetingscope and precision of base editing with engineered cas9-cytidine deaminasefusions. Nature biotechnology, 2017, 35: 371

[8] Li X, Wang Y, Liu Y, et al. Base editing with acpf1–cytidine deaminase fusion. Nature biotechnology, 2018, 36: 324

[9] Wang L, Xue W, Yan L, et al. Enhanced base editing byco-expression of free uracil DNA glycosylase inhibitor. Cell research, 2017,27: 1289

[10] Komor AC, Zhao KT, Packer MS, et al. Improved base excision repairinhibition and bacteriophage mu gam protein yields c: G-to-t: A base editorswith higher efficiency and product purity. Science advances, 2017, 3: eaao4774

[11] Hu JH, Miller SM, Geurts MH, et al. Evolved cas9 variants withbroad pam compatibility and high DNA specificity. Nature, 2018, 556: 57

[12] Jiang W, Feng S, Huang S, et al. Be-plus: A new base editingtool with broadened editing window and enhanced fidelity. Cell research, 2018,1

[13] Koblan LW, Doman JL, Wilson C, et al. Improving cytidine and adenine base editors byexpression optimization and ancestral reconstruction. Nature biotechnology,2018,

[14] Zafra M, Schatoff E, Katti A, et al. Optimized base editors enableefficient editing in cells, organoids and mice. Nature biotechnology, 2018,

[15] Traxler EA, Yao Y, Wang Y-D, et al. A genome-editing strategy totreat β-hemoglobinopathies that recapitulates a mutation associated with abenign genetic condition. Nature medicine, 2016, 22: 987

[16] Wienert B, Martyn GE, Kurita R, et al. Klf1 drives the expression offetal hemoglobin in british hpfh. Blood, 2017, blood-2017-2002-767400

[17] Wienert B, Funnell AP, NortonLJ, et al. Editing the genome tointroduce a beneficial naturally occurring mutation associated with increasedfetal globin. Nature communications, 2015, 6: 7085

文献精读

更多阅读

画图三字经 生信视频 生信系列教程 

心得体会 癌症数据库 Linux Python 

高通量分析 在线画图 测序历史 超级增强子

培训视频 PPT EXCEL 文章写作 ggplot2

海哥组学 可视化套路 基因组浏览器

色彩搭配 图形排版 互作网络

后台回复“生信宝典福利第一波”获取教程合集

您可能也对以下帖子感兴趣

文章有问题?点此查看未经处理的缓存