基因编辑新突破：一种高活性和低脱靶的新型基因编辑工具——FrCas9

CRISPR-Cas核酸酶是目前最为广泛使用的基因编辑工具，在基础科研以及临床应用方面都有着广阔的应用前景[1]。然而，目前应用最广泛的SpCas9始终面临的一个关键问题是脱靶效应。它会导致基因突变、甚至癌症等毒副作用，严重阻碍SpCas9在基础研究和临床中的应用[2]。为了解决脱靶效应问题，近年来有许多的研究集中于对现有的SpCas9进行改造，提高其切割特异性[3,4]。然而，改造后的SpCas9虽然脱靶效应明显减少，但其靶点切割活性也会受到影响。
珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，聚焦于利用基因编辑技术治疗多种病毒感染及相关肿瘤疾病，是最早进入基因治疗领域的研究团队之一。目前公司已开发出多种具有自主知识产权的新型CRISPR基因编辑工具。近日，我们团队研发出一种切割效率高、脱靶效应低的新2型CRISPR-FrCas9,该研究"FrCas9 is a CRISPR/Cas9 system with high editing efficiency and fidelity"成功发表于Nature Communications。原文网址：https://www.nature.com/articles/s41467-022-29089-8

   通过已建立的流程化新型CRISPR筛选鉴定平台，我们发现来自啮齿粪杆菌Faecalibaculum rodentium的一种新型FrCas9核酸酶，是目前已知的切割效率最强、脱靶效应最低、特异性最好、PAM限制最少的CRISPR，显著优于目前最常用的SpCas9。FrCas9属于Type II-A型CRISPR，与SpCas9的同源性小于80%，体积为1372个氨基酸（图A、B）。

FrCas9的PAM为5′-NNTA-3′，SpCas9的PAM为5′-NGG-3′，我们直接在人基因组上选择11个位点同步比较FrCas9与SpCas9及不同SpCas9高保真变体（SpCas9-HF1、HiFi-Cas9和eSpCas9）的切割效率及脱靶效应。在这里我们用到的方法为舒桐医疗科技自主研发的GUIDE-seq脱靶检测技术（舒桐医疗是目前国内唯一一家提供脱靶检测服务的公司）。结果显示，FrCas9的在靶reads数均高于SpCas9及其高保真变体，且FrCas9在多个位点均未检测到脱靶，说明FrCas9具有较高的切割效率以及较低的脱靶效应(图C、D)，为安全高效的基因编辑临床治疗及基础科研提供更多选择。

有趣的是，我们发现FrCas9的PAM（NNTA）为回文序列（图E），即：同一个PAM区域，正链和负链各存在一个靶点。因此，我们进一步将FrCas9突变为nicking形式的切口酶（nFrCas9），包括RuvC I区1个（D20A）、RuvC II区1个（E796A）、RuvC III区3个（H1009A、H1010A、D1013A）、HNH区2个（H877A、N902A），分别与CBE（BE4Gam）和ABE（ABE7.10）搭配，发现E796A突变位点的nFrCas9编辑效率最高，其CBE及ABE的编辑窗口分别为6-10位碱基以及6-8位碱基，二者在ClinVar数据库中的编辑范围分别有90.38%和92.21%（图F）。与SpCas9对应碱基编辑器不同的是，FrCas9独特的回文PAM可以同时编辑PAM上下游序列，进而拓宽FrCas9基因编辑器的范围，因此FrCas9在单碱基编辑上具有极大的应用潜力。

另外，多数真核生物基因转录起始点上游约-30bp（-25～-32bp）处存在TATA box，其一致顺序为TATAATAAT，RNA聚合酶结合在TATA box后启动基因转录，因此对于调控基因表达，TATA box是最直接简单的选择。由于FrCas9的PAM为NNTA，与TATA box序列完美匹配，可直接靶向基因TATA区域，可应用于如下场景：1)基因敲除。通过切割TATA-box，FrCas9使ABCA1、UCP3和RANKL的表达分别降低了31.37%、49.91%和39.62%，达到基因敲除的目的；2)基因转录抑制。dFrCas9可通过抑制RNA聚合酶与TATA-box的结合进而抑制目标基因转录。通过结合TATA-Box,FrCas9使ABCA1、UCP3和RANKL的表达量分别降低了61.67%、45.61%和42.60%；3)基因转录激活。通过CRISPR激活实验表明dFrCas9-VP64能够有效地进行转录激活，且在ABCA1、GH1和MBL2中的激活效率高于dSpCas9-VP64（图G、H）。Frcas9为基础科研提供了直接的基因调控工具。

       目前，舒桐医疗建立了成熟的GMP级别蛋白纯化，已完成包括SpCas9、FrCas9、AsCpf1、LbCpf1在内的多种工具酶的纯化，可供广大客户根据需求选择。

FrCas9产品及应用

1.提供GMP级别的FrCas9蛋白；2.与sgRNA在体外结合使用，进行体外切割，验证sgRNA的活性及切割效率;3.转染到细胞中靶向切割进行基因编辑;4.注射到胚胎或动物体中进行体内基因组编辑。                                

FrCas9产品优势

1.高纯度高活性的Cas9蛋白，切割效率强、脱靶效应低、特异性好、PAM限制少；2.所纯化的Cas9蛋白都进行了活性验证，无核酸酶污染;3.提供工业级大包装：可按要求进行不同规格定制。

产品管线

如需获得更多信息，请咨询我们：

电话：

027-63496883

13666673257

18062766516

企业官网：

http://www.generulor.com

产品订购/技术支持：

[e-mail]

参考文献：

1. Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell157, 1262-1278 (2014).

2. Tsai SQ, et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol33, 187-197 (2015).

3. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol31, 827-832 (2013).

4. Doench JG, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol34, 184-191 (2016).

—END—

---

为促进细胞与基因治疗领域的合作交流，更好的服务广大读者朋友，微信公众号“细胞与基因治疗领域”组建了专业的细胞与基因治疗行业交流群，长按下方二维码，添加小编微信进群。由于申请人数较多，添加微信时请备注：院校/企事业单位名称—专业/职务—姓名。如果您是PI/ 教授/主管及以上职务，还请注明。

---

往期文章推荐：

声明：本文旨在知识共享，所有内容仅学术交流研究，不构成任何建议。