基因治疗的投资要素分析
作者 l 郭佳 来源 l 维渡纵横（WeDimension）
一
AAV载体和基因治疗
AAV是一种单链DNA细小病毒，其基因组包括rep基因和cap基因，两侧有两个末端反向重复序列(ITRs)。rep基因由单个ORF、Rep78、Rep68、Rep52和Rep40编码，帮助AAV基因组复制和病毒粒子组装。三种衣壳蛋白(病毒蛋白VP1、VP2和VP3)由单个cap ORF生成，但由一个罕见的起始密码子(ACG)转录调控和可变剪接，因此，VP1和VP2的C末端与VP3具有相同的氨基酸。此外，装配激活蛋白(AAP)对衣壳装配至关重要，它由cap基因内的一个框内折叠ORF编码。所有AAV病毒粒子均由60个VP亚基组成，VP1:VP2:VP3的比例为1:1:10。每个亚基在病毒粒子表面有9个可变区域，它们决定AAV载体的主要取向和细胞内运输，通常是中和抗体(NAbs)识别的区域。基因修饰这些可变区域可以改变AAV的转导效率和NAbs与病毒粒子表面的结合能力。
AAV的结构和基因组
研究表明AAV通过在细胞表面结合主受体和共受体感染靶细胞，从而触发其内吞进入内小体。在结构改变暴露了VP1和VP2的N末端后，AAV病毒粒子从核内体中释放并在细胞核周围区域积累。AAV病毒粒子一旦进入细胞核，就会脱壳并释放其单链基因组，并将其转化为双链DNA (dsDNA)模板，在双链DNA模板上进行转基因的转录和翻译。
AAV载体转导途径
重要的是，只有145 bp的ITRs对于rAAV的增殖是必要的，ITR能够诱导转基因表达，在载体生产和确保在细胞中持久转导发挥重要作用。因此，基本上96%的AAV基因组可以被移除，以允许对AAV载体改造而进行基因治疗。
到目前为止，已经分离和研究了至少12个自然血清型和100多个变异的AAV作为基因传递载体，并从这些载体中不断生成AAV突变体，以优化AAV用于基因传递的使用。不同的AAV血清型具有不同的结合受体和组织趋向。
在rAAV转导过程中，衣壳的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答会清除rAAV转染的靶细胞，从而降低转基因表达导致治疗失败，而CTL反应的水平依赖于靶细胞上呈现的衣壳特异性抗原的水平，这和器官移植手术中的急性免疫排斥很类似。比如在所有血友病研究中，rAAV介导的FIX基因在患者中的表达低于临床前动物模型：给予每公斤体重1×10E11剂量的rAAV8–FIX使F9敲除小鼠血液中的FIX水平提高到野生型小鼠FIX水平的160%；然而对灵长类和人类给予每公斤体重2×10E11个rAAV8–FIX，相对于健康个体，血液FIX水平仅增加40%或<1%。
在rAAV转导成功后，基因表达盒会产生先天免疫反应，会产生类似移植手术中的慢性免疫排斥反应，导致基因治疗药物在体内发生长期毒性、表达量无法控制，并很快在体内沉默。
通过基因修饰rAAV载体即载体工程，优化AAV的基因表达盒和衣壳，可以提高AAV的转导率、安全性和体内存活时间。下文将着重分析其成药的关键因素。
二
载体工程是成药关键
01
基因表达盒工程
AAV转导率的限制是由于在mRNA转录开始之前，需要从单链AAV基因组合成dsDNA，这一必经的分子步骤是由ITRs启动的。通过突变一个野生型ITRs，可以克服rAAV感染后合成第二链的需要。因此，突变的ITR不适合作为Rep68和Rep78蛋白的底物，从而阻止了复制的末端分解，导致特异性的自互补AAV (scAAV)中间体的产生。scAAV中间体包含了正链和负链的DNA，当被包裹在病毒粒子衣壳中时，与野生型AAV不同，只包装了一个单链的正链或负链的DNA基因组，当scAAV中的基因表达盒被改变的ITR融合，两个互补的部分被送到细胞核时，立即退火形成dsDNA，立即发生转录。值得注意的是，由scAAV编码的GFP或FIX比传统单链AAV载体编码的GFP或FIX表达更快，表达水平更高。2019年，FDA批准了治疗脊髓性肌萎缩（SMA）的基因治疗药物Zolgensma，而scAAV载体正是其重要组成部分，该基因治疗药物由AveXis公司研发，2018年被诺华制药以87亿美元并购。
尽管ITR的合理设计增加了AAV转导效率，但scAAV载体的使用依旧是有限制的，他们只能容纳不高于2.5kb的基因表达盒，提高AAV包装能力可以进一步提高scAAV技术的应用。
>>> 启动子(Promoter)的工程化
首先，由于AAV的包装容量有限，必须对包括启动子在内的所有顺式元件进行优化；同时，结合不同特异性启动子和增强子元件，生成小型启动子和增强子，用于rAAV的有效包装和转导。例如，Chuah等全基因组筛选鉴定出14个肝细胞组织特异性顺式作用调节模块，长度从41-551 bp不等，包含进化保守的转录因子结合位点基序簇；含有顺式作用的调控模块元件和肝脏组织特异性启动子的rAAV基因表达盒在小鼠中的表达量是仅含启动子的rAAV的10 ~100倍。事实上，生物技术公司已经把重点放在优化基因治疗的启动子上，下一代rAAV载体可能来自模块化的组件，这些组件都已针对AAV表达进行了优化，并在临床研究中进行了测试。
近年来，越来越多的制药公司发现启动子不单单和基因表达量有关，更重要的是会影响基因治疗作为药物的安全性(免疫反应)和表达时限。启动子本身并无编译功能，但它拥有对基因翻译氨基酸的指挥作用，就像一面旗帜，其核心部分是非编码区上游的RNA聚合酶结合位点，指挥聚合酶的合成，这种酶指导RNA的复制合成，一旦该段位的启动子发生突变/变异，将对基因的表达有着毁灭性作用。
rAAV传递的转基因可引发适应性免疫反应，包括CTL反应和抗治疗蛋白异源抗体的形成，使用组织特异性启动子可以防止先天免疫反应和防止其在抗原呈递细胞中的表达并减少转基因诱导的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应。研究显示，在rAAV转导成功后依旧会产生免疫应答，特别是直接选用外源性的通用型启动子如CMV、CAG等而没有任何结构的改良，会产生类似移植手术中的慢性免疫排斥反应，导致基因治疗药物在体内发生炎性反应、表达量无法控制（快速升高后急剧下降），并很快在体内沉默，这些现象虽然还没有足够多的文章发表，但是已经引起基因治疗领域的高度重视。
过往在rAAV载体中使用的启动子大多为单向通用型启动子，如CMV、CBA、CAG、PGK、EF-1α，来实现在细胞中的高表达；虽然设计并筛选出组织特异性启动子要比通用型启动子复杂很多，但组织特异性启动子可开启一个更具细胞特异性和自然的表达谱，增加目标基因表达效能，并且不易沉默。例如两个rAAV-RPE65基因疗法使用了两个组织特异性启动子，一个1.6 kb长的RPE65启动子和一个缩短为750 bp (NA65p)的启动子，其中rAAV-NA65p-RPE65基因表达载体也有其他修饰（SV40内含子、Kozak序列、密码子优化）以提高hRPE65表达的效力和细胞特异性，发现在视网膜中，改造过的NA65p启动子比长启动子RPE65更少被沉默；研究显示，CMV启动子在视网膜、海马体、脊髓或黑质中起初会促进急剧表达，十周后开始出现沉默现象（在纹状体中CMV未发现快速沉默现象），而改用光感受器组织特异性启动子则在上述组织中都可持续表达；另外，由于rAAV的包装容量有限，像CBA/CAG (1661 bp)这样的长序列启动子在最近的临床试验产品中已经并不常见。
组织特异性启动子的缺陷是体积较大、目标基因表达量比CMV低，但是经过设计优化和筛选，已经有不同的组织特异性启动子应用于眼科，表达量和CMV等通用型启动子数量级相当，并且不易在体内沉默。
高光坪教授在其2019年发表的综述中提到，特异性表达是基因治疗的一个重要方面，在脱靶组织或细胞类型中的基因表达可能导致毒性或触发不必要的免疫反应。从rAAV基因组设计的角度来看，最好的策略就是让基因在特定部位持续表达，需要通过使用组织特异性启动子和/或融合miRNA的3ʹ-UTR结合位点，这涉及到承载高水平miR-142-3p的抗原呈递细胞，在基因表达盒中包含miR-142-3p结合位点，可以有效降低抗原呈递细胞中转基因的表达，并极大地降低对转基因产物的免疫排斥反应。
Synpromics启动子技术
截至目前，通过公开数据得知，目前国内至少有2家应用组织特异性启动子的基因治疗公司，分别为信念医药、诺洁贝。
另外，基因治疗一直被认为存在固有的风险，因为一旦它们被传递到患者的细胞中，就永久性的改变了患者的遗传物质且无法被关闭或调整。因此，诱导型基因治疗也开始在临床上应用，基本思路是开发具有基因开关作用的诱导型启动子。美国斯克里普斯（Scripps）研究所的Michael Farzan博士和其团队发现了一种可逆性的RNA开关，可通过注射反义吗啉环寡核苷酸( morpholino)在体内调控AAV转基因的表达。这一研究成果于2019年12月23日发表在《Nature Biotechnology》上，为基因治疗开发者提供了可行的技术来调整治疗性基因的活性水平。这一技术似乎解决了一个主要的安全问题，从而可能使这种基因治疗策略得以更多地使用。国内叶海峰团队也开发了一种阿魏酸调节的基因开关。在应用方面，国外的Intrexon和Ziopharm已经将诱导型基因治疗推进到了II期临床研究。
>>> 转基因(Transgene)的工程化
>>> AAV载体的包装
许多转基因，比如编码肌营养不良蛋白的基因(治疗杜氏肌萎缩症所需的基因)，FVIII(用于治疗血友病A)和视网膜特异性磷脂转运ATP酶ABCA4(用于治疗视网膜变性疾病如黄斑变性疾病)等，由于体积太大而不能有效地包装成AAV病毒粒子。一些大体积转基因在剪切后已被用于临床试验并获得了成功，近年科学家们也开发了其他一些策略，可以使用AAV载体在动物体内传递更大体积的转基因。
第一种方法是利用AAV传递后，通过ITR序列的同源重组将AAV基因组合并。大体积的基因表达盒可以分到两个或更多的载体，并运送到相同的细胞，病毒在细胞核中脱壳后，片段之间同源重组形成完整的转基因组。这种方法已经在动物身上成功地传递了2-3个独立的AAV载体，并成功表达了功能性肌萎缩蛋白。
第二种方法是，被截断的基因片段在载体基因组上不限定的位置被包装成不同的AAV病毒粒子，AAV病毒粒子的混合群体中含有不同长度的截断基因片段，这些转导后的双重AAV载体，通过将两个不同的AAV载体基因组重叠区域进行同源重组，或者通过单链模板将不同的AAV载体基因组在互补区域进行退火，从而产生完整的基因表达盒。特异性的重叠片段也可以添加到每个AAV载体的末端，促进同源重组。
第三种方法是为了克服前两种方法的局限性，上述方法缺陷在于共聚合可以得到无功能的重组产品，使用截断的重叠基因片段会在转基因的中间部分产生一个不需要的ITR结构。杂交双载体策略结合了重叠区域和内含子剪接位点，这种方法依赖于AAV基因组的共聚合活性，通过重组将独立的AAV载体基因组聚合到一起，以确保转导后产生正确的转基因蛋白，这一策略可能会增加全功能蛋白的表达。
第四种方法是将AAV基因组交叉包装到其他细小病毒的衣壳中。
02
衣壳工程
除了自然发现的AAV，设计AAV衣壳的主要技术有三种：合理设计、定向进化和计算辅助设计。
>>> 定向进化
定向进化是模拟自然进化的机制，在衣壳蛋白中引入大量随机突变，然后在选择压力下筛选出具有特定生物性质和特征的衣壳。另外，在离散区域或整个cap基因上的易错聚合酶链反应（error-prone PCR）也是筛查生成衣壳库的一种可行方法。
>>> 自然发现
AAV最初被发现为细胞培养污染物，这就是最广泛使用的血清型AAV 2；目前最具有临床应用潜力的AAV血清型都是从天然来源中分离出来的，其中的典型范例就是AAV9，它是从人类肝组织中分离出来的。目前已经分离和研究了至少12个自然血清型，如下表所示。
流行病学分析表明，40%-80%的人血清抗AAV抗体呈阳性反应，这表明人源性衣壳可能并不是最理想的基因治疗载体，因为已经存在的AAV衣壳免疫可能会降低传导效率。解决这一难题的策略包括使用从非人灵长类中分离的AAV衣壳，以及其它脊椎动物中分离的AAV衣壳蛋白。目前，从非人灵长类动物和猪身上获取的AAV衣壳种类在实验中表现出良好的转基因递送能力。
>>> 合理设计
合理设计是改良病毒载体衣壳的首选策略之一，第一种方法是将特定多肽序列嫁接在衣壳表面，让它们可以与特定细胞表面的受体相结合。
另一种方法是扰乱细胞对衣壳蛋白的降解过程。定点突变表面暴露的酪氨酸残基，通过抑制蛋白酶体降解和促进细胞内转运，促进靶细胞转导。
>>> 生物信息学和计算机辅助设计
生物信息学和计算机工具可以通过比较不同AAV的衣壳蛋白序列，推断出衣壳蛋白的进化过程，并且发现衣壳蛋白上具备高度多样性的区域。结合高通量测序，可以使用生物信息工具来设计衣壳变异库，以确定允许操作的高变异性区域。
美国生物技术公司 Dyno Therapeutics 推出其专有平台“CapsidMap”，该平台把 AI 运用在当前的基因治疗技术中，可以设计新颖的腺相关病毒（AAV）载体，公司宣布与诺华和 Sarepta Therapeutics 达成了合作关系，共同开发针对眼部疾病、神经肌肉和心血管疾病的基因疗法。
三
躲避免疫障碍
中和抗体(NAbs)结合到腺相关病毒(AAV)载体病毒粒子的表面，以防止AAV病毒粒子与靶细胞相互作用并进入靶细胞，并阻止AAV病毒粒子在细胞核内的有效的细胞内运输和脱壳（1）；AAV病毒粒子通过内吞作用进入细胞后，在核内体中降解，使AAV基因组或衣壳暴露于toll样受体9 (TLR9)或TLR2等受体，通过MYD88驱动途径触发先天性免疫应答，需要注意的是，不同类型的细胞可能包含不同的先天免疫传感器（2）；一些AAV病毒粒子能成功逃脱核内体进入细胞质，它们的衣壳在蛋白酶体中被泛素化并降解为小肽和表位（3）；这些小肽和表位被装载在MHC I类分子上，呈现在靶细胞表面，使细胞被识别，并最终被特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应所消除（4）；AAV病毒粒子到达细胞核并脱壳（5）；转录发生，正链和负链RNA由AAV基因表达盒的ITRs生成，并输出到细胞质中形成双链RNA（6）；双链RNA被dsRNA传感器MDA5/RIG-I识别（7），激活了先天免疫反应（8）；转基因表达后，任何错误折叠的蛋白在蛋白酶体中被降解（9），产生的小肽和表位再次结合MHC I类并触发CTL对转基因组的反应，以至于AAV转导的靶细胞可被转基因特异性CTL识别和清除（4）；最后，治疗产物可被分泌到循环中，并被抗原呈递细胞吸收以激活B细胞，产生抑制剂，通过体液免疫反应中和治疗蛋白（10）。
影响rAAV基因治疗的免疫学障碍
01
躲避先天免疫反应
02
躲避适应性免疫反应
躲避中和抗体
根据已发表的研究，>90%的人感染了AAV，约50%的人可能有中和抗体（NAbs）。对于需要全身使用AAV载体才能成功治疗的患者，例如患有神经系统疾病和肌肉紊乱的患者，NAbs尤其成问题。
非遗传学的方法来降低NAb水平包括使用药物，如利妥昔单抗和雷帕霉素，阻止B细胞产生NAbs；或通过单采血浆技术(Plasmapheresis)，减少NAbs血滴度；或使用脂质体或细胞来源的胞外囊泡覆盖AAV抗原表位，防止他们被NAb识别；然而，这些策略要么效率低，要么改变AAV生物学特性，要么增加AAV衣壳抗原载量。
对AAV衣壳直接进行基因改造以避开NAbs可能是最优的选择，科学家们正尝试使用合理设计和定向进化的AAV衣壳来做到这一点。
对AAV病毒粒子如何与特异性单克隆抗体相互作用的进一步了解，使我们能够合理设计出更多能够逃脱NAb活性的AAV突变体，不影响载体的产生、转导效率或组织趋向性。AAV颗粒上的NAb识别位点可能在进化上是保守的，并位于一个特定的区域，该区域残基的合理突变可以使突变病毒规避NAbs的识别。例如AAV2单克隆抗体A20识别AAV2衣壳的多个残基，包括VP1的265残基区域，并阻断AAV2转导，通过合理的设计，AAV2衣壳被设计成AAV2.5，它在VP1的265残基处发生突变，使A20无法识别或阻止A20对细胞的转导。
定向进化也被用于分离AAV突变体。例如在采用易错聚合酶链反应（error-prone PCR）方法，产生AAV2衣壳随机突变文库，在AAV抗体阳性的人血清中筛选后，分离出对HEK293细胞具有高趋向性和能够逃避NAbs的突变体。
规避CTL反应
通过合理设计，AAV衣壳也可以被设计用于避免衣壳特异性CTL反应。AAV转导导致衣壳抗原在靶细胞表面交叉呈递，这种交叉呈递由MHC I类抗原呈递途径介导，由泛素介导AAV衣壳降解。AAV衣壳中赖氨酸残基的泛素化能被蛋白质磷酸化促进，赖氨酸残基或酪氨酸或丝氨酸磷酸化位点的突变会增强AAV在细胞中的转导。此外，AAV衣壳的磷酸化位点突变，以避免泛素化和蛋白酶体介导的衣壳降解，逃脱了衣壳特异性CTL介导的对转导的靶细胞清除。
四
rAAV的生产与纯化
工业界正在努力帮助科学家将基因疗法快速推向市场，已经开发出一些产品来支持质粒和病毒载体的生产。
AAV生产工艺流程
01
AAV载体的生产
制造足够的AAV载体用于临床试验是一个挑战，特别是对于治疗神经或肌肉疾病的基因治疗，通常每公斤体重使用>1×10E14的剂量。目前AAV载体制备常用的方法为三质粒共转染HEK293细胞；另外一种是使用昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统（BEVS）。
用BEVs载体感染Sf9昆虫细胞进行rAAV生产是用杆状病毒Baculovirus携带Rep/Cap基因及ITR基因组，去感染悬浮培养的SF9昆虫细胞，包装出rAAV。该系统可通过穿梭载体灵活装载外源基因的片段，并在细菌内高效重组到杆状病毒基因组上，再将抽提出的重组杆状病毒基因组DNA经转染Sf9昆虫细胞，产生有感染活性的重组杆状病毒。然后，利用重组杆状病毒（BEV）感染悬浮培养的Sf9细胞生产rAAV，上市药物Glybera就是用的这种方法。
此外还有稳定细胞株生产方法，建立起含有rAAV的Rep/Cap基因或ITR基因组的稳定细胞株（常用Hela细胞），再用辅助病毒来感染生产出rAAV。此方法的缺点是稳定细胞株的建立与鉴定需要很长时间，需要注意细胞株多次传代后的稳定性。
02
AAV载体的纯化
目前提纯AAV的技术有两种：密度梯度离心和亲和层析纯化，组合这些方法可以确保更高纯度的AAV产品。几种AAV配体已被用于亲和层析、包括肝素、粘蛋白、A20单克隆抗体、AVB琼脂糖亲和树脂；利用AAV衣壳表面的表位进行纯化也进行了探索；例如，AAV载体可以被生物素化或改造编码hexa组氨酸标签（His6标签），分别用抗生物素蛋白或Ni-NTA柱进行纯化；某些AAV血清型对于AVB琼脂糖亲和树脂的亲和力能够通过合并具有最高亲和力的AAV血清型的关键残基而被增强，同时不影响载体的转导效率。由于AAV工程一般不会明显改变其分子量和结构，对AAV衣壳进行基因修饰虽然会影响亲和层析，但不太可能影响密度梯度离心。
值得注意的是，由于空衣壳或包装不完全的衣壳和含载体的衣壳具有相同的氨基酸组成，亲和层析不能区别它们（离子交换层析除外）。AAV空衣壳被用作诱饵来阻止NAbs识别含有载体的衣壳，尽管它们增加了AAV衣壳的抗原载量，可能引起不必要的免疫反应。近年来，开发了一种新型的亲和层析和离子交换层析双柱纯化平台，该平台可与多种AAV血清型兼容，该方法制备的AAV载体纯度高，空衣壳污染少。
五
评价基因治疗的有效性
虽然在AAV载体工程方面取得了进展，但是在一些动物模型中显示阳性结果的rAAV可能在其他物种中无效,而由于直接在人体内实验又是是不切实际和不道德的，因此需要开发能够评估AAV转导和预测载体在人体试验中的有效性的系统。
01
动物模型
虽然多种动物模型已被用于评估治疗效果、毒性和对AAV基因治疗的免疫反应，但小鼠模型的结果不能对大型动物、人类甚至其他小鼠品系进行100%的推断。例如，用于治疗小鼠血友病的类似剂量的AAV载体，在大型动物和人类中分别降低了10倍和100倍的治疗效果；此外，从C57BL小鼠的大脑中分离的AAV PHP.B对这些小鼠脑的转导效率比AAV9更高，但并没有改善对其他小鼠品系或动物物种大脑的转导。为了克服这些问题，科学家建立了人源化的小鼠模型来测试rAAV血清型和rAAV在含有人类组织的小鼠中的转导效率。
02
类器官或3D组织培养
类器官或3D组织培养系统可用于评估AAV的转导效率。类器官是由特定细胞分化而成的体外三维微型器官，用于研究疾病的发病机理和治疗方法；由于类器官由人体细胞产生，它们可能比动物模型更能反映人体的生理状况，但到目前为止，所有的类器官模型都表现出胎儿样组织表型，这可能限制了它们在评估AAV转导效率方面的应用。
六
结论与展望
AAV基因疗法在临床应用中依旧面临着挑战，包括人类的转导效率低于在动物模型中的转导率、AAV衣壳或转基因组的免疫反应、低效的AAV病毒生产和纯化方法、缺乏可靠的系统来评估预测人体临床试验的AAV转导效率以及高昂的生产纯化成本。AAV的载体工程有可能克服这些障碍，我们也确实看到AAV衣壳工程可以增加AAV的转染性，使AAV能够逃脱NAbs；基因表达盒工程可以增加转基因的表达并防止先天免疫反应和适应性免疫反应。越来越多的动物模型和类器官模型被开发和应用，将会为基因治疗从动物到人体的转导率预测提供更多的有力手段。
将AAV转化为基因治疗载体的过程需要分子生物学、生物信息学、传染病学、结构生物学、免疫学和基因组学等多学科的联合研究。随着国内科技水平的不断提高和政策的大力支持，近两年来越来越多的海内外基因治疗科学家成立创业公司，出现了诸如信念医药、赋源生物、嘉因生物、诺洁贝、至善唯新、纽福斯、辉大基因、克睿基因、中因科技、安龙生物、和元生物、五加和、派真生物、源兴基因等公司，掀起国内基因治疗的浪潮。