东华大学史向阳教授团队：微流控合成纤连蛋白包覆的聚多巴胺纳米复合物用于自补充肿瘤微环境调节和MR成像引导下的三模态联合治疗

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在靶向杀死癌细胞的同时对机体的正常组织和细胞无毒副作用，这在临床实践中仍面临巨大的挑战。不同于正常组织，肿瘤微环境（TME）表现出诸多独特的特征，包括弱酸性pH、缺氧、内源性过氧化氢（H₂O₂）、过量的谷胱甘肽（GSH）和免疫失衡，这可能既是肿瘤耐药的主要因素，也是目前肿瘤治疗的主要障碍。然而，从另一个角度来看，肿瘤在TME中独有的特征也可能会成为改善肿瘤治疗的一个充满前景的突破口。化学动力学治疗（CDT），作为一种高选择性和内源性激活的治疗方式，在肿瘤特异性治疗中已经展现出巨大的潜力，并且能够减少全身性毒副作用。特别是过渡金属基纳米材料在缺氧的TME下，解离的金属离子与H₂O₂发生芬顿（Fenton）或类芬顿（Fenton-like）反应，生成羟基自由基（×OH，一种ROS），引发细胞凋亡，从而实现癌症的CDT。然而，TME中过量的GSH（2-10 mM）和内源性H₂O₂不足（∼100 mM）会分别通过有效消耗产生的ROS和阻碍ROS的大量生成，严重降低CDT的效果。因此，通过可控的TME调控或增强的ROS生成来提高CDT就显得至关重要，并且基于CDT的多模态协同治疗已在改善癌症治疗效果方面展现出巨大潜力。

青蒿琥酯（ART）是传统中药青蒿素的一种衍生物，含有活性基团内过氧桥键，具有良好的抗癌活性和可忽略的毒副作用。值得注意的是，ART的内过氧桥键可被Fe²⁺还原，生成高毒性的超氧自由基（×O₂^-，一种ROS），造成胞内脂质过氧化物的积累、蛋白质和DNA的损伤，诱导癌细胞凋亡。因此，通过增加细胞内ROS和避免TME中H₂O₂的缺乏，ART已经被用于实现高效CDT，这可以很好弥补Fenton或Fenton-like反应因TME中内源性H₂O₂不足而导致ROS产量受限的缺陷。然而，疏水性、不稳定性、较差的药代动力学和生物利用度限制了ART在肿瘤治疗中的临床应用。尽管多种基于ART的纳米平台已被开发用于肿瘤治疗，但仍然存在非特异性、单模态治疗疗效有限和仅由内源性Fe²⁺刺激生成的ROS不足等诸多问题，都极大地限制了其治疗效果和转化应用。

此外，具有肿瘤特异性靶向能力的纳米平台可以通过改善纳米药物在肿瘤部位的积累来进一步提高抗肿瘤效果。纤连蛋白（FN）作为一种具有良好生物相容性的蛋白质，其中心细胞结合域含有Arg-Gly-Asp多肽序列，可以特异性地靶向a_vb₃整合素过表达的肿瘤细胞。然而，简单地制备具有多种成分、均一稳定的“一体化”纳米平台用于肿瘤诊疗仍然存在巨大的挑战，这也延缓了纳米医学的临床转化进程。在纳米平台的化学合成方面，微流控技术通过控制反应动力学、反应液类型、液体混合方式和反应温度等来精确控制多组分反应和纳米平台的组成、形貌和尺寸分布。并且，微流控技术已被用于制备各种用于肿瘤诊疗的基于介孔硅、超小超顺磁性氧化铁、金和脂质体的高质量纳米平台。特别是，为了高效地制备高质量纳米平台，通过调节侧面入口和中间入口的流量比来引起微漩涡，实现输入流体的快速混合，从而有效地封装所有组分，得到高质量的纳米平台。

为了制备高质量的纳米平台，用于自供应型持续调控TME，实现纳米药物的高效靶向递送、磁共振（MR）成像和肿瘤的联合治疗，东华大学史向阳教授团队基于微流控技术开发了FN包覆的负载ART的聚多巴胺铁纳米复合物（FDRF NCs）用于靶向MR成像引导的肿瘤化疗/CDT/免疫治疗联合治疗（图1）。研究团队以FN、ART、多巴胺盐酸盐（DA）和四水合氯化亚铁为原料，基于微流控方法合成了尺寸均一的FDRF NCs。为了比较，研究团队用牛血清白蛋白（BSA）替代FN，制备了FDRF NCs的类似物（FDRB NCs）。对比发现，FDRF NCs展现出更好的癌细胞摄取效果和肿瘤靶向能力。同时，FDRF NCs还具有良好的pH响应的药物释放性能和自补充增强的ROS生成能力。

图1. FDRF NCs的微流控制备及其T₁ MR成像引导的肿瘤化学-化学动力学-免疫三模态联合治疗的示意图。

研究团队通过一系列表征证明了FDRF NCs具有良好的pH响应性药物释放性能、pH增强的T₁ MR成像性能和双途径增强的ROS生成性能。然后通过CCK-8和细胞吞噬实验证明，FN介导的对α_vβ₃整合素高表达的4T1细胞的靶向能力能够明显促进FDRF NCs的细胞摄取，有效改善了FDRF NCs在癌细胞内的聚集。同时，不同浓度FDRF NCs的溶血率都低于5%的安全阈值，表明FDRF NCs具有良好的血液相容性（图2）。

图2. FDRF NCs在不同pHs条件下的水合粒径（A）、Fe（B）和ART（C）的释放曲线、T₁ MR成像以及弛豫率r₁（D）；MB在不同条件下随时间的降解曲线（E）；MB在FDRF NCs + pH 6.5 + H₂O₂（10 mM）条件下随时间的降解情况（F）；不同材料处理的细胞活力检测结果（G）；FDRB NCs或FDRF NCs与4T1细胞共孵育不同时间后对铁的摄取情况（H）；不同浓度FDRF NCs的溶血率（I）。

随后，研究团队在体外探究了FDRF NCs的抗肿瘤活性和机制。研究结果表明，基于Fe²⁺介导的Fenton反应和ART的还原分解双途径生成ROS，FDRF NCs能够显著提高癌细胞内ROS的含量。并且，通过Fe³⁺对GSH的氧化，FDRF NCs能够显著降低癌细胞内的GSH水平。同时，Fe³⁺和Fe²⁺之间的经典循环反应被实现，从而能够持续调控TME，进一步诱导癌细胞内脂质过氧化物（LPO）的积累和激活凋亡通路诱导癌细胞凋亡（图3）。并且，FDRF NCs能够显著诱导4T1细胞的免疫原性死亡（ICD），进一步熟化树突细胞（图4）。

图3. 不同处理后4T1细胞内的ROS水平（A）、GSH水平（B）和LPO积累水平（C）；以及4T1细胞凋亡情况（D）和凋亡相关蛋白Western-Blot图（E）。

图4. 不同处理后4T1细胞释放ATP的水平（A）、HMGB1的水平（B）和4T1细胞膜表面暴露CRT的水平（C-D）；FDRF NCs处理的4T1细胞与树突细胞共孵育示意图（E）；不同处理后树突细胞的熟化情况（F）。

研究团队进一步研究了FDRF NCs在4T1皮下瘤模型中的T₁ MR成像性能和抗肿瘤性能。结果表明，该材料能够在肿瘤部位聚集，并且展现出良好的T₁ MR成像效果。抗肿瘤结果显示，FDRF NCs联合PD-L1抗体（A-PD-L1）能够显著诱导体内癌细胞坏死和凋亡，以及抑制肿瘤增殖，展现出最显著的抗肿瘤效果，并明显提高小鼠的生存率。另外，从肺部HE切片中可以观察到，FDRF NCs的治疗有效抑制了4T1癌细胞的肺转移（图5）。

图5. 尾静脉注射不同材料后小鼠体内T₁ MR成像图（A-B）；FDRF NCs + A-PD-L1联合治疗的时间表（C）；治疗结束后，不同组小鼠的相对肿瘤体积变化曲线（D），生存率变化曲线（E），相对体重变化曲线（F），肿瘤切片的HE、TUNEL和Ki-67染色结果（G），以及肺切片的HE染色结果（H）。

最后，研究团队进一步评估了FDRF NCs联合A-PD-L1介导的免疫检查点阻断（ICB）对荷瘤小鼠体内抗肿瘤免疫响应的激活情况。研究结果表明，FDRF + A-PD-L1能够促进CD4⁺辅助T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞的瘤内浸润，下调瘤内免疫抑制调节性T细胞水平，从而逆转免疫抑制TME，显著增强抗肿瘤免疫治疗。

图6. 不同治疗后，小鼠肿瘤组织切片的CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的免疫荧光染色情况（A）；小鼠肿瘤部位的CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的比例（B）、Tregs的比例（C）；小鼠血清中IL-6（D）、TNF-a（E）和IFN-g（F）的细胞因子水平。

简言之，该研究设计的FDRF纳米平台的主要优势在于以下几个方面：1）通过微流控合成方法制备的高质量FDRF NCs，可以实现FN介导的ART和Fe²⁺的靶向共递送，显著增强CDT效果；（2）通过Fe²⁺介导的ART还原/Fenton反应和Fe³⁺介导的GSH氧化反应之间的经典循环反应实现了自补充和持续的TME调控，能够实现放大的ICD介导的免疫细胞激活；（3）通过A-PD-L1介导的ICB疗法和增强的ICD介导的免疫激活的联合，FDRF NCs可以实现肿瘤的精准诊疗。

以上研究成果以“Microfluidic synthesis of fibronectin-coated polydopamine nanocomplexes for self-supplementing tumor microenvironment regulation and MR imaging-guided chemo-chemodynamic-immune therapy”为题，发表于国际著名期刊Materials Today Bio（DOI: 10.1016/j.mtbio.2023.100670）。东华大学生物与医学工程学院博士研究生杨瑞为第一作者，东华大学史向阳教授为通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划项目、上海市科委等项目的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2023.100670

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