CAR-T细胞治疗：如何突破实体瘤微环境的阻碍
与血液学疾病相比，CAR-T细胞用于治疗实体瘤存在一些限制，包括缺乏能强有力表达的肿瘤特异性抗原靶点，以及高度免疫抑制和代谢性挑战的TME(肿瘤微环境)，TME会限制治疗的安全性和疗效。这篇综述介绍了一些蛋白质和细胞工程策略，以克服这些障碍，产生具有增强肿瘤特异性和持续效应功能的下一代T细胞，用于实体恶性肿瘤的治疗。
该综述首先讨论了靶抗原的选择，这是过继性T细胞治疗安全性和有效性的主要决定因素。
1、确保肿瘤特异性
原则上，理想的肿瘤抗原应该在肿瘤细胞上高度且一致地表达，但在健康组织上不表达。然而，血液和实体恶性肿瘤地绝大多数肿瘤抗原靶点在健康细胞亚群中都有抗原表达，因此，用过继转移地T细胞靶向肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens, TAAs)，而非肿瘤特异性抗原，会有靶向、非肿瘤毒性的风险，且多年来的临床报告展示了靶向、非肿瘤毒性效应的严重性。
其中靶向PAN-B细胞标记物CD19的CAR-T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已显示出不错的临床反应，但CD19 CAR-T细胞的成功治疗也总是导致B细胞再生障碍性疾病，这是靶向CD19的可预见性结果，可以通过输注免疫球蛋白来治疗。靶向其它TAAs的T细胞也同样导致了不希望发生但临床上可控制的不良事件，甚至在黑色素瘤患者接受表达MART1或gp100的特异性TCR治疗中发现，在没有强有力的抗肿瘤反应的情况下，也可能发生靶向、非肿瘤毒性。
上述都是可预测到的靶向毒性，然而在某些临床试验中，未预测到的非靶向毒性效应已经导致了危及生命的并发症。例如，黑色素瘤相关抗原(MAGEs)是健康成人组织中不存在但在各种癌症中过度表达的肿瘤睾丸抗原(CTAs)，然而，在9名接受靶向MAGE-A3 TCR的T细胞治疗的患者中，有3名出现了严重的神经毒性，并致2例死亡，这是由于MAGE-A3 TCR与大脑中意想不到的 MAGE-A12表达的交叉反应。
鉴于间皮素在各种实体瘤的过度表达及其在健康间皮细胞中的有限表达，间皮素已成为一种有前景的实体瘤TAA，且多个机构进行的临床试验表明了其最小的靶向、非肿瘤毒性效应。然而，尽管有良好的安全性，靶向间皮素的CAR-T细胞作为单一疗法在临床试验中显示出有限的疗效。最近的一项I期临床试验将靶向PD-1的mAbs(单克隆抗体)与靶向间皮素的CAR-T细胞经胸膜内注射相结合，取得了令人鼓舞的疗效。
鉴于靶向TAAs而不是唯一抗原的风险，已经开发了几种工程化策略来改善CAR-T细胞的靶向肿瘤特异性。一种策略是微调CAR与其同源抗原的亲和力，使得只有过表达靶抗原的肿瘤细胞被杀死，而具有正常表达水平的健康组织被保留，但是这种策略需要健康细胞和肿瘤细胞之间抗原表达水平有巨大差异。
另一种策略是设计靶向肿瘤相关糖肽表位的CAR，CAR是由细胞外配体结合域与细胞内共刺激和激活域融合而成的合成受体(图1a)。已经开发了仅在存在特定抗原组合的情况下激活T细胞的多输入受体，以增加CAR分子的肿瘤靶向特异性。因为有效的CAR-T细胞活化需要T细胞活化信号和共刺激信号，所以将两个信号分成两个受体，每个受体靶向不同的抗原可以实现更高水平的规格，要求两种抗原在触发之前存在强大的T细胞反应。要做到这一点，第二代CARs可以分成与第二嵌合共刺激受体（CCR）配对的第一代CAR（没有共刺激结构域），所述第二代嵌合共刺激受体包含与一种或多种共刺激域融合但没有CD3ζ链的scFv(图1b）。第一代CAR只提供T细胞激活信号，CCR只提供共刺激信号。每个受体的抗原必须同时存在才能触发强大的CAR-T细胞反应，从而产生Boolean AND- gate logic。
图1 CARs是具有可编程抗原识别的人工合成模块化受体
另一种AND-gate策略可以通过使用合成Notch (synNotch)受体系统来实现，这需要整合两个转基因的慢病毒——一个是由组成型启动子表达的synNotch受体，另一个是由诱导型启动子表达的CAR。synNotch受体由一个细胞外配体结合域(如CD19结合的scFv)、一个来自Notch受体的跨膜域和一个正交转录因子(如转录激活融合蛋白Gal4-VP64)组成(图1b)，该转录因子在配体结合时通过蛋白水解释放。当synNotch受体与其同源配体(如CD19)结合时，会释放其转录因子来诱导CAR的转录。当CAR蛋白与其自身独立的同源抗原(如失活的ROR1(酪氨酸激酶跨膜受体1))结合时，随后可以触发T细胞的激活。与需要同时识别抗原A和B的CAR-CCR组合不同，synNotch系统是一个顺序AND-gate，其中synNotch受体在CAR表达和识别抗原B之前识别抗原A。synNotch/CAR-T细胞被证明可以消除EGFRvIII(表皮生长因子变异体III)表达异质性的GBM(胶质母细胞瘤)患者来源的PDX(异种移植)，同时限制EphA2/ IL13Rα2(肝配蛋白-A2/白介素-13受体亚单位α-2) CAR对大脑的活性，以将潜在的肿瘤外毒性降至最低。
除了AND-gate logic之外，CARs可以通过仅在TAA存在的情况下触发T细胞活化，而不是存在在健康细胞表达的抗原的情况下触发T细胞活化来增加靶向特异性(Boolean AND- NOT logic)。实现AND- NOT logic的一种方法是通过分裂，通用和可编程（SUPRA）CAR系统，其中T细胞被工程化以表达包含与跨膜和细胞内信号结构域融合的亮氨酸拉链胞外域的“zipCAR”。缺乏配体结合结构域的zipCARs必须用外源zipFv蛋白重建—与匹配的亮氨酸拉链融合的scFvs—以在TAA存在下实现T细胞活化。人们可以同时使用第二类zipFv分子，其设计旨在与zipCAR竞争与第一zipFv的结合，以防止在自身抗原存在下重建功能性CARs，从而实现Boolean AND- NOT logic(图1c)。
上述AND或AND-NOT gate设计要求两个输入信号都存在于靶细胞表面，限制了可靶向抗原的种类。尽管基于AND或AND-NOT的Boolean logic策略可以提高目标特异性，但它们也必须克服一些限制，这些限制包括增加肿瘤逃逸的风险，转导效率和遗传稳定性的降低。
2、克服抗原异质性
不需要复杂基因回路设计就能避免靶向、非肿瘤毒性的理想方法是选择肿瘤细胞真正特异性的抗原，肿瘤特异性抗原的一个罕见例子是EGFRvIII，它是一种EGFR的致癌突变形式，通常在GBM中发现。然而，EGFRvIII的表达是由肿瘤细胞对治疗的反应动态调节的，而GBM通常是高度异质性的，因此如果仅靶向EGFRvIII等单一抗原，那么只有一小部分肿瘤细胞会被杀死。事实上，许多其他类型的实体肿瘤在抗原表达上也是高度异质性的，这对靶向治疗(如CAR-T细胞治疗)提出了重大挑战。此外，抗原逃逸—一种抗原表达下调或丢失的肿瘤逃避检测的现象—构成了一个类似的挑战，限制了治疗效果。
为了更有效地针对异质肿瘤，出现了一种涉及工程化单链双特异性CARs的策略，CARs包含两个配体结合域，可以识别两种不同的肿瘤抗原，其中任何一种抗原都足以触发T细胞激活(图1d)。通过靶向CD19和CD20的组合或CD19和CD22的组合，已经在白血病和淋巴瘤的治疗中下证明了这种双特异性CARs。靶向B细胞成熟抗原(BCMA)和SLAM家族成员(SLAMF7，也称为CS1)的双特异性CAR-T细胞也能够克服多发性骨髓瘤小鼠模型中的抗原逃逸。人们还可以通过在同一T细胞上共表达不同的CARs，来同时编码靶向多种肿瘤抗原的特异性(图1d)。
值得注意的是，扩大肿瘤识别的策略可能会同时增加靶上和肿瘤外毒性的风险。克服这一限制的一种策略是对多抗原靶向进行分层处理。例如，EGFR在正常组织中广泛表达，因此它是CAR-T细胞治疗的不良抗原靶点。然而，通过改造溶瘤腺病毒(OAds，其特异性地感染恶性肿瘤细胞)，以分泌针对EGFR的双特异性T细胞结合蛋白(BiTE)，已经实现了对EGFR的安全靶向。
3、细胞内靶点和新抗原
新抗原是通过患者特异性肿瘤突变产生的新表位，可以作为T细胞治疗肿瘤特异性靶点的来源。肿瘤活检全外显子组测序后，可以通过计算预测新抗原。尽管生物信息学算法能够可靠地识别体细胞突变，但预测MHC分子处理和显示新抗原表位仍然是一个活跃的研究领域。在黑色素瘤患者中，基于合成肽的新抗原疫苗的施用能使肿瘤消退而无严重的自身免疫毒性，突出了以疫苗形式靶向新抗原的吸引力。
新抗原特异性T细胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)中分离出来，也可以通过转基因表达新抗原反应性TCR而产生。由于TILs经常被发现具有分化和耗尽的表型，根据新的证据显示，分化程度较低的T细胞具有更高的介导肿瘤控制的能力，它们在发挥抗肿瘤控制方面的效果可能较差。然而，新抗原反应性TCR可以在分化程度较低的T细胞亚群中转基因表达以增强更强的抗肿瘤反应，但是鉴于天然存在的肿瘤反应性T细胞的稀有性，新抗原反应性TCR的分离和表征是具有挑战性的。基于新抗原的治疗对于肿瘤突变负荷高的癌症是一种很有前景的方法，但对于突变负荷低的癌症仍然具有挑战性，因为只有一小部分体细胞突变产生T细胞反应性新表位。
其次讨论了免疫抑制TME带来的挑战以及克服这一障碍的工程化策略。
1、促进CAR-T细胞浸润
一旦注入癌症患者体内，CAR-T细胞将面临TME带来的各种挑战。与播散性循环肿瘤相反，实体肿瘤通过分子和细胞机制的相互作用网络，呈现出排斥肿瘤浸润性T细胞的物理屏障。包括趋化因子和其他化学信号的表达，这些信号优先招募抑制性免疫细胞；基质细胞(如癌相关成纤维细胞(CAF))，促进致密的纤维化环境，限制T细胞通过异常的细胞外基质(ECM)沉积进行运输；血管系统失调，T细胞浸润所必需的粘附分子表达下调(图2)。
图2 限制实体瘤治疗效果的T细胞外在因素
趋化因子是控制实体肿瘤中细胞毒性T细胞浸润程度的主要分子决定因素。在许多实体瘤中，趋化因子表达谱偏向于优先招募抑制性细胞类型，同时避免炎性抗肿瘤免疫细胞。为了避免固体TME的异常趋化因子特征并促进过继转移性T细胞的浸润，多项研究已经对CAR-T细胞进行工程化以表达趋化因子受体，该受体识别TME中上调的趋化因子。例如，在神经母细胞瘤和胸膜间皮瘤的小鼠模型中，共表达C-C趋化因子受体CCR2(与CCL2结合，CCL2是一种在几种癌症中上调的趋化因子)的CAR T细胞表现出增强的浸润和抗肿瘤功效。
转化生长因子-β（TGFβ）是另一种化学信号，对排除实体瘤中的细胞毒性T细胞方面起着重要作用。除了通过下调趋化因子受体(如CXCR3)直接作用于T细胞以限制肿瘤浸润外，TGFβ还在基质细胞中发出信号以促进保护肿瘤免受免疫监视的表型。TGFβ激活的基质细胞可上调胶原等ECM蛋白的产生，形成一个致密的物理网络，限制T细胞的运动。在TME的基质细胞中，CAFs因其在促进肿瘤进展和阻止免疫细胞向肿瘤转移方面的广泛研究作用而备受关注，被认为是一个有前途的治疗靶点。
鉴于在促进CAF分化中的作用，TGFβ已被确定为克服肿瘤基质介导的免疫排斥的有吸引力的靶点。然而，全身普遍表达的TGFβ的全身抑制可导致心脏毒性作用。相反，NADPH氧化酶4(NOX4，TGFβ信号传导的下游)的药理学抑制对CAF提供更高的特异性，因此毒性风险更小。在小鼠中，抑制NOX4导致富含CaF的肿瘤中CD8+T细胞浸润增加，并使这些肿瘤对抗PD1检查点阻断敏感。调节肿瘤间质的策略还没有与CAR-T细胞治疗相结合，但可能是未来研究的一个有前途的途径。
除了靶向实体肿瘤免疫排斥的细胞驱动因素外，另一种方法是靶向免疫排斥的分子驱动因素。由于ECM蛋白质是构成TME所呈现的物理屏障的很大一部分，因此有一种策略涉及能够降解ECM蛋白质的工程化CAR-T细胞。具体而言，分泌乙酰肝素酶（降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖）的GD2 CAR-T细胞能够在体外降解ECM，并在体内更有效地浸润肿瘤异种移植物，从而提高治疗小鼠的存活率。抑制分子前列腺素E2(PGE2)在许多固体TME中含量丰富，也可以靶向促进T细胞的浸润。CAR-T细胞表达一种小肽，破坏PGE2信号的下游靶蛋白激酶A(PKA)的正确定位，不仅可以更有效地杀灭肿瘤细胞，还可以通过增加CXCR3的表达和与肿瘤细胞和内皮相关的分子(如纤维连接蛋白和血管细胞黏附蛋白1(VCAM1))的良好黏附而更有效地浸润肿瘤。另一个限制免疫浸润的主要物理因素是实体肿瘤周围的血管系统失调。肿瘤血管系统的特点是高度弯曲的血管，具有异常的血流特征，导致肿瘤缺氧，并通过下调黏附分子(如VCAM1)和 ICAM1(细胞间黏附分子1)来限制T细胞外渗进入肿瘤组织。使肿瘤血管正常化和促进免疫浸润的策略包括靶向血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素信号轴。
在某些癌症类型中，与传统的静脉输注相比，更直接的输注方法可以避免T细胞浸润不足。在恶性胸膜间皮瘤的原位异种移植模型中，与静脉输注相比，经胸膜内输注靶向间皮素的CAR-T细胞产生了更好的治疗效果。与静脉内和肿瘤内给药相比，CAR-T细胞的局部区域给药可改善治疗效果，这一发现表明，半系统给药途径，其中治疗细胞群可以在可能发现肿瘤细胞的空间受限区域内循环，可在效应器功能的覆盖范围和集中度之间提供最佳平衡。
作为优化T细胞给药途径的补充方法，T细胞对实体肿瘤的渗透可以通过构建细胞输送平台来进一步增强。具体地说，CAR-T细胞可以嵌入到功能化生物聚合物支架中，这种支架可以促进T细胞的强劲扩张，当植入肿瘤切除部位时，会持续释放细胞。为了释放更强大的抗肿瘤免疫反应，生物聚合物支架也可以被设计成与其它免疫治疗剂共同输送CAR-T细胞。Coon等人105，镍钛合金薄膜可以作为CAR-T细胞输送的植入性支架，使肿瘤组织能够强劲扩张。在不能切除的卵巢癌异种移植模型中，植入含有CAR-T细胞的薄膜比静脉或局部注射CAR-T细胞更有效地控制肿瘤生长。与生物聚合物支架相比，镍钛合金薄膜声称还有一个额外的优势，因为它们体积更小，可以容纳更精确和可重复性的T细胞负载，这在大规模制造临床应用的细胞时可能特别有意义，这样的研究突出了跨学科方法能更好地治疗实体肿瘤的潜力。
2、抗TME中的免疫抑制
除了对T细胞浸润的物理屏障外，TME还存在抑制性细胞类型，如促进免疫耐受的调节性T细胞（Treg细胞）、髓系来源的抑制性细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。TME的趋化因子和细胞因子表达谱不仅起到排除细胞毒性T细胞的作用，而且还优先从外周招募免疫抑制细胞，并可使肿瘤部位的现有免疫细胞向免疫抑制表型分化。通常在固体TME中过度表达的细胞因子，包括TGFβ、VEGF、IL-4和IL-10，它们可以直接抑制T细胞功能并促进抑制性免疫细胞的积聚，被招募的抑制细胞本身也能产生免疫抑制细胞因子，增强TME的耐受状态。
在抑制性TME中增强抗肿瘤免疫的一种方法是给T细胞配备合成受体，以抑制或重新连接对这些可溶性因子的内源性反应。已经报道了多种靶向TGFβ的合成受体的多种变体，包括TGFβ DNR(显性阴性受体)、TGFβ受体(TGFβR)-4-1BB嵌合体和TGFβ反应性CAR，每个受体编码对TGFβ的不同反应。为了靶向多种免疫抑制细胞因子，第一代前列腺干细胞抗原(PSCA)-CAR、IL-4R–IL-7R嵌合体和TGFβR–4-1BB嵌合体已在T细胞中同时表达，在以IL-4和TGFβ高表达为特征的部位赋予有效和特异的肿瘤细胞杀伤作用。CAR-T细胞还配备了可以重定向抑制性PD1–PDL1轴和肿瘤坏死因子受体超家族成员TNFRSF6(也称为FAS)及其配体TNFL6(也称为FASL)信号轴的合成受体。在胸膜间皮瘤的异种移植瘤模型中，肿瘤细胞上高水平的PDL1表达抑制了靶向间皮素的CAR-T细胞的抗肿瘤功能，PD1-DNR的共表达在体外和体内都增强了CAR-T细胞的功能。
除了靶向TME中的免疫抑制分子外，“装甲”CAR-T细胞经工程化设计可分泌促炎细胞因子，如IL-12、IL-18和IL-23，可以有利地塑造TME以增强抗肿瘤免疫。分泌IL-12或IL-18的CAR-T细胞可向TME招募炎性M1巨噬细胞，CAR-T细胞自分泌IL-12或IL-18信号可增强 IFN-γ(干扰素-γ)的分泌，抑制Treg细胞的增殖，从而保护T细胞免受Treg细胞介导的抑制。IL-23促进T细胞增殖，由p19和p40亚基组成，其中只有p19亚基被T细胞激活后上调。只表达p40亚单位的工程化T细胞只在T细胞激活后才能产生功能性IL-23，这可以最大限度地减少组成性IL-23表达潜在的毒性。此外，与表达IL-18的CAR-T细胞相比，该策略增强了CAR-T细胞在多种同种和异种移植瘤模型中的抗肿瘤功能，具有更好的疗效。
除了克服TME的分子方法外，还有几种疗法旨在抑制TME中发现的抑制性细胞类型。特别是，人们越来越认识到抑制性髓系细胞(最明显的是TAMs(肿瘤相关巨噬细胞)和MDSCs(髓源性抑制细胞))在实体瘤环境中的作用，它们由不同细胞状态的异质混合物组成。针对髓系间室的特定治疗干预措施包括CSF1R(抑制集落刺激因子1受体)，该受体消耗TAMs，并经初步研究已与化疗或检查点阻断联合使用。
总而言之，至少在某些情况下，CAR-T细胞疗法本身可以重塑TME，以更好地促进抗肿瘤功能。然而，考虑到在实体肿瘤中观察到的CAR-T细胞治疗反应普遍较差，进一步的工程化方法以充分释放内源性抗肿瘤免疫反应可能是必要的，其中一种途径是招募APCs(抗原提呈细胞)。
3、维持T细胞代谢补充
除了免疫抑制的细胞介质外，TME的代谢特征对抗肿瘤免疫非常不利。有效的CAR-T细胞反应包括CAR-T细胞的增殖、细胞因子的分泌和肿瘤细胞的杀伤——所有这些都是代谢要求很高的。因此，TME中CAR-T细胞的代谢补给对于维持有效抗肿瘤反应的能量需求至关重要。内在和外在因素都会影响TME中的CAR-T细胞代谢，从而影响CAR-T细胞的治疗能力（图3）。
图3 CAR-T细胞在肿瘤微环境中面临内源性和外源性代谢挑战
对于TME中的CAR-T细胞来说，在营养贫乏的环境中争夺代谢资源是一个挑战。癌细胞通常有失调的细胞代谢来支持致癌生长。一个很好的特征是“Warburg效应”，其中癌细胞主要依靠有氧糖酵解而不是更有效的线粒体氧化磷酸化来维持生物量的产生，因此，肿瘤细胞能够在TME中与T细胞竞争葡萄糖。由于T细胞活化涉及有氧糖酵解的快速诱导，糖酵解T细胞代谢特征与效应T细胞功能增加有关， T细胞葡萄糖缺乏会导致磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）不足，导致TCR信号和效应器反应减弱，可通过补充PEP 进行补救，补充醋酸盐也可以恢复葡萄糖限制性T细胞中IFN-γ的表达，小分子糖酵解抑制剂也能够改善对检查点抑制剂免疫治疗的反应。
耗竭的T细胞的代谢特征是线粒体呼吸抑制，葡萄糖摄取和糖酵解通量降低，线粒体功能受损。过表达PGC1α(过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子1α)可以改善T细胞的代谢适应性，从而抵抗T细胞耗竭。以线粒体为靶点的抗氧化剂治疗可以通过抵消线粒体活性的破坏来恢复CD8+效应器T细胞的功能。另一个T细胞固有的代谢限制是烯醇化酶1的翻译后损伤，其机制尚未确定，导致不能产生PEP和下游糖酵解代谢物丙酮酸，随后抑制效应器T细胞功能。效应器T细胞功能所需的糖酵解活性可以通过过度表达PCK1(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1，能将草酰乙酸酯转化为PEP)或通过外源性补充PEP或丙酮酸来挽救。另一个抑制T细胞抗肿瘤能力的代谢特征是TIL中SPHK1(鞘氨醇激酶1)的上调，它通过SPHK1-鞘氨醇1-S1P(磷酸)-PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体-γ)轴使T细胞向免疫抑制性Treg细胞表型分化。
限制CAR-T细胞功效的外在代谢因素包括TME中存在的免疫抑制代谢物。一个例子是吲哚胺2,3-IDO(双加氧酶)-色氨酸-犬尿氨酸轴，它通过多种机制抑制T细胞效应器功能。一方面，由于营养竞争导致TME中的色氨酸耗竭阻止雷帕霉素的有效机制靶点(mTOR)功能，从而阻止T细胞活化；同时，IDO将色氨酸转化为犬尿氨酸直接抑制效应T细胞和NK细胞，同时招募和活化MDSCs；另一方面，接受抗PD1治疗的患者的犬尿氨酸与色氨酸比率增加与患者生存率低下相关。然而，在III期临床试验中，使用IDO1抑制剂（epacadostat）和PD1抑制剂（pembrolizumab）的联合治疗并未改善pembrolizumab单抗的疗效。作为一种替代方法，在同基因小鼠模型中，注射聚乙二醇化犬尿氨酸酶（可直接降解犬尿氨酸）与检查点抑制剂治疗有协同作用。工程化T细胞对IDO-色氨酸-犬尿氨酸轴的直接调节仍然是一个值得探索的有很多可能性的。
代谢直接影响T细胞适应性的无数方式表明，重新编程T细胞以校准其代谢通量——这可以通过遗传学和药物手段实现——可能是增强TME中T细胞功能的一种卓有成效的方法。
4、预防CAR-T细胞耗竭
在TME中，CAR-T细胞在慢性刺激下容易耗竭，从而影响有效的抗肿瘤免疫。T细胞耗竭可以广泛地表现为效应器反应功能障碍、持续的共抑制受体表达以及重新编程的转录和表观遗传状态。
一些转录因子也被确定为T细胞耗竭的驱动因素，如TOX，它现在被认为是驱动与耗竭的T细胞相关的表观遗传重塑的关键转录因。NR4A转录因子家族和PTPN2(蛋白酪氨酸磷酸酶非受体2型)也被认为是CD8+T细胞耗竭的转录驱动因子。TCF1(转录因子T细胞因子1)也被认为是“祖细胞耗竭”的CD8+T细胞的干细胞标志物，它决定了T细胞进入末端效应器或耗竭T细胞的命运。
随着对T细胞耗竭生物学认识的不断加深，基因工程策略已被开发出来以重新活化和增强CAR-T细胞反应。例如，最近的研究报告，带有Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3三重敲除的CAR-T细胞显示在携带黑色素瘤的小鼠中，显示出肿瘤控制得到改善，耗竭程度降低。CAR-T细胞和免疫检查点抑制剂的联合疗法也成功地对抗了胸膜间皮瘤、白血病、黑色素瘤和卵巢癌小鼠模型的T细胞耗竭。
最后简要概述了与CAR-T细胞治疗相关的已知毒性，并介绍了可能有助于减轻治疗相关毒性以及提高CAR-T细胞治疗安全性的工程化方法。除了前面讨论过的靶向、非肿瘤毒性作用外，接受CAR T细胞治疗的患者有时还可能出现致命的副作用，如CRS和神经毒性。
1、细胞因子释放综合征(CRS)
CRS是由一种高水平的免疫反应触发的，在这种反应中，激活的CAR-T细胞诱导其他免疫细胞产生细胞因子，触发一个正反馈循环，导致危险的血清细胞因子浓度。CRS通常使用抗IL-6Rα抗体(如tocilizumab)、TNF抑制剂(如etanercept)或皮质类固醇进行治疗。CRS的标准治疗是在检测到临床症状后开始的，此时CRS已经开始，在某些情况下，已经超过了有效的治疗控制点，因此，预防CRS而非补救CRS的策略可能是非常有利的。
2、神经毒性
与CRS一样，神经毒性的大部分临床例子来自于血液系统恶性肿瘤的治疗，目前还不清楚这样情况是否会发生在实体肿瘤中。CAR-T细胞诱导神经毒性的机制尚未阐明，但有一种假说认为，高水平的细胞因子激活内皮细胞会增加血脑屏障的通透性，导致炎性T细胞在脑脊液中积聚。临床治疗通常是使用皮质类固醇，然而，CRS和神经毒性的最佳治疗策略并不完全一致，因为有人推测，托西珠单抗通过与IL-6受体结合有效地缓解CRS，在治疗神经毒性时，由此产生的游离IL-6可以被动地扩散到中枢神经系统，被证明可能是有害的。最近的单细胞测序分析揭示了一组表达CD19的健康壁细胞，这表明在CD19 CAR-T细胞治疗的临床试验中观察到的神经毒性实际上可能是CD19 CAR-T细胞特异的靶上和肿瘤外毒性的结果，根据这些发现，观察到的神经毒性可能最好通过努力提高肿瘤靶向性的工程化来解决。
3、CAR-T细胞的安全与控制
考虑到与CAR-T细胞治疗相关的固有风险，内置于CAR-T细胞或与CAR-T细胞联合应用的诱导性安全控制的策略是可取的。自杀基因可以被实施到CAR-T细胞中，在小分子介导的自杀基因诱导下导致细胞死亡。iCasp9(诱导型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9)是由人类来源的自杀基因产生的，由FKBP(FK506结合蛋白)和截短的caspase9组成的融合蛋白表达，其以单体的形式失活。生物惰性小分子AP1903通过FKBP诱导iCasp9的二聚化，从而激活caspase9介导的凋亡(图4a)。然而，自杀开关通常会导致给药的CAR-T细胞永久耗竭，从而迫使治疗终止。
图4 CAR-T细胞的安全性和控制可以通过遗传学或药理学策略来管理
一种通过药物控制激活或暂停CAR信号的新策略可以让医生在给患者输液后暂时调节CAR-T细胞的活动，以防止耗竭或严重的不良事件。据报道，使用酪氨酸激酶抑制剂(dasatinib)，通过暂时干扰CAR-T细胞信号转导通路，发生了一种短暂的药理学CAR-T细胞关闭开关。大多数传统的CARs通过CD3ζ传递T细胞激活信号，而CD3ζ依赖于(LCK(淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)的磷酸化和 ZAP70(ζ链TCR相关蛋白激酶70 kDa)。因此，根据给药方案 (图4b)，dasatinib可以部分或完全抑制CAR信号。此外，其活性可由小分子配体控制的蛋白质降解标签已被用来调节CAR蛋白的表达，从而使CAR-T细胞信号暂时失效，而不需要消除CAR-T细胞群体。例如，通过将蛋白酶靶点、蛋白酶和降解物融合到CAR的C端，设计了一种关闭(SWIFF)CAR。在没有小分子蛋白酶抑制剂的情况下，蛋白酶靶位被切割，保护CAR不受降解。在小分子蛋白酶抑制剂的存在下，降解产物保持融合并降解CAR(图4c)。使用这些策略，医生可以使用小分子药物来抑制CAR-T细胞的活性，直到毒性症状或毒性本身消退。
STOP-CAR系统是另一种策略，它结合了化学上不知名的异二聚体（CDH）结构域，使药物介导的CAR-T细胞活性暂停。STOP-CARs由识别链（包括scFv和共刺激结构域）和信号链（包括CD3ζT细胞信号结构域）组成，重要的是，识别链和信号链都包含CDH结构域，这些结构域会自发二聚形成功能性的第二代CAR。小分子药物会破坏CAR的功能性二聚化，从而破坏CAR-T细胞的活性。通过临床批准的药物对CAR-T细胞活性的时间控制可以显著缓解安全问题，这些问题通常伴随着旨在提高CAR-T细胞疗法疗效和潜在毒性的工程化策略。
近年来的几项研究揭示了CAR-T细胞如何与实体瘤相互作用，指出T细胞的内在和外在因素在非血液肿瘤环境中的治疗效果不佳，但该领域的进展表明了有新的线路有希望可以产生更适合治疗实体瘤的CAR-T细胞。例如，越来越多的非细胞癌症免疫疗法(如PD1抑制剂)的机理研究，可以指导合理地设计与CAR-T细胞疗法的最佳和协同地组合。此外，新地T细胞工程方法化和复杂的基因编辑技术也将是抗击TME方面取得突破的重要驱动力。虽然CAR-T细胞的生产趋向于更普遍的“一刀切”方法，但更个性化的方法——生物信息学的进步和患者数据集的不断增加——将指导靶抗原选择和迎合每个人需求的联合疗法。总而言之，要有效地克服实体肿瘤带来的许多治疗障碍，很可能需要一种结合了尖端生物技术的多方面方法。
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