综述50多个靶标的PROTAC降解剂，这些科学问题亟需解决

过去几十年，小分子和单克隆抗体（mab）极大地改变了癌症的治疗。单抗的高选择性和高亲和力有利于减轻副作用，但其分子尺寸限制了细胞通透性，尚不能靶向胞内蛋白。小分子具有好的生物利用度和较低的生产成本，但大多数转录因子、骨架蛋白和非酶蛋白等尚缺乏有效的治疗药物，这些蛋白质被认为是“不可成药”的靶点。

从作用模式（mode of action，MOA）来看，小分子是通过占据活性口袋来发挥作用的；其需要高剂量来维持活性，这会增加脱靶风险并导致不良影响。此外，难成药靶点的表面通常是平坦的，传统的小分子难以附着；而突变蛋白构象的变化，也会导致对小分子耐药。此外，靶蛋白的持续抑制可能导致下游信号的反馈激活，导致代偿性蛋白过度表达，这可能显著增加获得性耐药的风险。

蛋白质水解靶向嵌合体（Proteolysis targeting chimera，PROTAC）是一种新的化学敲除兴趣蛋白（protein of interest，POI）的策略。PROTAC由三种特殊元素组成：E3泛素连接酶配体、POI配体和连接体。E3泛素连接酶配体负责特异性招募E3泛素连接酶；POI配体用于靶向和劫持POI；连接体部分用于结合这两个配体。特殊的双功能小分子是一种强大的化学工具，通过形成稳定的三元复合物，促进POI的多泛素化和随后的蛋白酶体介导的POI降解，使POI接近E3连接酶（图1）。

图1 PROTAC的原理图 

一个PROTAC分子包括一个弹头来瞄准POI（红色三角形），一个E3配体（绿色正方形）来招募E3连接酶和一个连接子（黑线）来将它们连接在一起。当PROTAC分子接近POI和E3连接酶时，E3将利用E2泛素结合酶将泛素转移到POI表面。然后蛋白酶体将识别多泛素化信号并降解POI。同时，PROTAC分子解离并参与下一个降解周期。

就MOA而言，PROTAC分子与传统的小分子抑制剂有着本质的区别。PROTAC是一种事件驱动的方式，基于泛素-蛋白酶体系统（UPS）诱导泛素化的瞬时结合，进而消除致病性蛋白质。随后，PROTAC可以在活性没有降低的情况下被回收，用于下一个目标蛋白的降解周期。

这种亚化学计量活性的MOA避免了高水平的给药和相应的不良反应。考虑到致病蛋白质必须在一定时间内重新合成，目标蛋白质的积累会被延迟。此外，降解是POI的一个迭代部署过程，与传统的小分子相比，POI不易增加靶基因的过度表达或突变。在某种程度上，PROTAC能够解决由传统抑制剂引起的获得性耐药性。由于PROTAC的降解机制与抑制剂有根本的不同，弹头只需要对受体有轻微的亲和力，因此理论上PROTAC有可能靶向多种难治性药物靶点。

2001年，先驱Craig M.Crews开发了第一个PROTAC分子。ARV-110是第一个口服小分子PROTAC雄激素受体（AR） 降解剂，用于治疗转移性去势耐药前列腺癌的临床试验正在进行中（NCT03888612，Arvinas）。本文重点综述了PROTAC靶向各种蛋白质的最新进展，系统阐述了PROTAC技术的优点，还详细讨论了这一领域可能面临的挑战和亟需解决的科学问题。

PROTAC靶向多种蛋白质的研究进展

通过检索近年来的相关文献，据不完全统计，PROTAC已经成功降解了50多种靶蛋白，主要包括：

• 蛋白激酶：BCR-Abl，BTK，c-Abl，ALK，CDK2，CDK4/CDK6，CDK8，CDK9，PI3K，Abl，FLT-3，AKT1-3，FAK，TBK1，SGK3，IRAK4，EGFR，PTK2，MEK1，MEK2，TrkC，JAK，PLK1，CK2，MCL1，BCL-2/BCL-XL和Wee1；
• 核受体：AR，ERα，细胞维甲酸结合蛋白[CRABPs]；
• 转录调节蛋白：BRD4、BET、HDAC6、BCL6、Pirin、MDM2、STAT3、Smad3、Aiolos（IKZF3）、IKZF1、IKZF、PRC2（EED、EZH2和SUZ12）
• 调节蛋白：RIPK2、Sirtuin 2、PCAF/GCN5、FKBP12、PARP1和TGF-β；
• 其他：KRASG12C、Tau、α1A肾上腺素能受体[α1A-AR]、IDO1、CYP1B1、BAF复合物和PDEδ等。

PROTAC的组织特异性

药物实现组织特异性的靶向作用，是疾病治疗尤其是癌症治疗的一个长期课题，它可以显著降低毒性。此外，组织特异性靶点是获取精确医学的有力策略。

并非所有的受体、酶或蛋白质在人体组织中都有相同的表达，E3泛素连接酶也不例外。越来越多的证据表明E3泛素连接酶在不同的组织中表达不同。最近，一项研究表明，CRBN E3连接酶和VHL E3连接酶在人血小板中的表达很低。ABT199是被FDA批准唯一一种BCL-2选择性抑制剂；而BCL-2和BCL-XL双重抑制剂ABT263因BCL-XL抑制触发靶向和剂量限制性血小板减少而被拒绝上市。在这种背景下，开发对血小板无影响的BCL-XL依赖性肿瘤靶向药物已迫在眉睫。由于血小板中VHL E3连接酶的表达水平很低，因此PROTAC衍生的二价小分子为靶向BCL-XL提供了一种对血小板无影响的策略。

将ABT263转化为细胞选择性BCL-XL PROTAC，得到DT2216分子（DC50=63 nM，Dmax=90.8%）。与推测一致，DT2216不仅提高了抗肿瘤活性，而且降低了血小板毒性。此外，DT2216不降解BCL-2，提示利用PROTAC技术可以通过招募肿瘤或组织/细胞特异性E3连接酶，将具有靶向组织特异性和剂量限制性毒性的抗肿瘤药物转化为肿瘤选择性、组织选择性和毒性较小的药物。

总之，我们坚信，利用E3连接酶的差异表达，结合光药理学等先进技术，PROTAC策略将在局部疾病治疗中找到一席之地，最终实现精准医疗。

PROTAC亟需解决的科学问题

到目前为止，大多数PROTAC分子都位于经典的Lipinski的“五法则”规律之外。因此，PROTAC作为治疗药物面临着独特的挑战。PROTAC的吸收、分布、代谢、排泄和毒性等研究还需要更多的理论和实践；提高细胞的摄取量和生物利用度，以维持必要的PROTAC浓度，仍然是一个巨大的挑战。第一个口服AR-PROTAC降解剂已进入临床开发阶段，表明许多预期的药代动力学挑战如通透性差和生物利用度低等是可以克服的。本文认为，为促进更多PROTAC药物进入临床研究，以下几个方面的科学问题亟需加强研究：

1）E3连接酶配体：E3连接酶是蛋白酶体介导的蛋白质降解的关键组成部分。人体内已知的E3配体有600多种，但到目前为止只有不到1%的E3配体是小分子。目前，超过90%的已报道的PROAC是通过CRBN、VHL、MDM2、cIAP1等少数几个E3连接酶招募的。PROTAC面临的主要挑战之一是扩展可用于PROTAC技术的E3泛素连接酶。能否在特定的细胞或组织中找到更特异的E3酶及其配体也是必须考虑的重大科学问题。

2）三元复合物：PROTAC只有在形成稳定的“靶蛋白-PROTAC-E3泛素连接酶”三元复合物时，才能有效且特异地泛素化靶蛋白。然而，复杂的三元晶体结构体系很难被捕获和识别，目前研究PROTAC介导的三元配合物的方法很少，主要包括时间分辨荧光能量转移（TR-FRET）、等温滴定量热法（ITC）、AlphaLISA、表面等离子体共振（SPR）等。虽然这些方法在三元络合物形成的分析中显示了一定的价值，但不能完全概括泛素-蛋白酶体体系对POI降解的要求。目前的工作主要集中在“靶蛋白PROTAC”或“泛素连接酶PROTAC”二元复合物的稳定性上，关于PROTAC介导的三元配合物的晶体结构报道较少。越来越多的证据表明，可行的三元复合物形成参数对PROTAC的细胞活性和理想属性非常重要。靶蛋白-PROTAC-E3三元晶体结构的稳定性有待进一步研究。

3）linker：PROTAC的连接链（linker）设计也很关键。线性烷基链或PEG结构具有很高的氧化代谢风险，大大降低了药物暴露的浓度和持续时间，并加速了PROTAC分子从体内的排泄。目前，指导PROTAC中间连接链设计长度和组成的设计原则尚不清楚。

4）活性评价：可靠的生物活性评价不容忽视。从PROTAC的MOA角度看，它具有亚化学计量的活性。用传统的方法测定PROTAC的药代动力学（PK）和药效学（PD）曲线是不可取的。最近的一项研究表明，PK和PD之间的脱节以及低纳摩尔效价超出了PROTAC的可检测PK存在范围，这在科学和安全的给药剂量方面形成了障碍。

5）Hook效应：此外，三元体系往往比二元体系更复杂。只有两个配体之间的有效协同，才能有力地引发降解。当用一定浓度的PROTAC治疗时，研究人员经常观察到轻微或严重的“hook效应”，这为确定理想的治疗窗口设置了障碍。Hook效应的出现意味着POI和E3配体的独立结合，同时阻止了三元复合物的形成，这可能导致严重的副作用。因此，建立一套快速、有效、准确、可重复、可靠的PROTAC生物活性评价体系是目前研究的热点。

6）合成方法：最后，PROTAC分子的复杂性对药物化学家提出了巨大的挑战。PROTAC分子的大量合成在很大程度上依赖于连接位点、连接长度等，这些都是系统研究的一大障碍。“点击反应平台”在扩大合成规模和扩大化合物库空间等方面为化学家提供了巨大的好处。通过“点击反应平台”生成有效的PROTAC分子已被广泛报道。Soural团队使用固相合成技术快速高效地合成了基于沙利度胺的PROTAC分子。Biao Jiang等人在温和的反应条件下开发了有机碱促进的来那度胺与不同卤化物的化学选择性烷基化反应，这为基于来那度胺的高度功能化PROTAC文库提供了一种新方法。未来化学研究者应致力于开发高效、绿色、温和的反应条件、显著的化学选择性和区域选择性以及无污染的合成技术或平台。为临床提供足够的活性药物成分（API），大规模生产也需要进一步探索。

任何干扰内源性蛋白质调节的药物都需要一个完美的设计和令人满意的特异性来调节一系列生物事件，这是一个历史性的挑战。相信通过学术界和医药界研究人员的共同努力，这些挑战在不久的将来能够得到圆满解决。

参考文献：doi: 10.1016/j.ejmech.2020.112981.Epub 2020 Oct 3

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