东华大学史向阳教授团队 AS：氧化还原响应型树状大分子纳米凝胶通过内质网应激放大和巨噬细胞极化实现超声增强的胰腺癌化学免疫治疗

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化疗是许多实体恶性肿瘤的主要治疗方法，因其缺乏靶向性，会形成更适合恶性肿瘤转移的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。该微环境中的肿瘤浸润细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）水平较低，而免疫抑制细胞如调节性T细胞（Tregs）和M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的水平较高，从而限制了化疗疗效。因此，选择合适的化疗药物靶点和调节免疫微环境的双重策略，将有效诱导机体的正向免疫应答反应，从而达到理想的治疗效果。

在众多化疗方式中，以内质网（ER）为靶点的治疗很有前景。众所周知，内质网是蛋白质折叠和运输的主要场所，参与多种细胞功能。肿瘤细胞的过度增殖导致错误折叠和未折叠蛋白的增加，从而引发内质网应激（ERS）。为了解决这个问题，肿瘤细胞启动一种生存机制恢复细胞稳态，称为未折叠蛋白反应（UPR）。IRE1α-XBP1是UPR中最保守的进化分支，调节相关基因的表达，恢复肿瘤细胞的稳态和生存。丰加霉素（Toy）是一种嘌呤核苷类似物，通过阻断IRE1α-XBP1信号通路，使肿瘤细胞产生持续性的内质网应激，从而引起肿瘤细胞凋亡和免疫原性死亡（ICD）。值得注意的是，持续性的化疗会使肿瘤细胞表面免疫检查点配体的表达上升，从而产生免疫逃逸。免疫检查点阻断（ICB）疗法通过使用程序性细胞死亡配体1（PD-L1）等抗体，可以重新激活T细胞，增强抗肿瘤免疫治疗。

为了实现肿瘤的高效治疗，需要开发集诊断和治疗于一体的纳米平台。金纳米粒子（Au NPs）具有较高的原子序数、X射线吸收系数和良好的生物相容性等优点，在计算机断层扫描（CT）成像中具有巨大潜力。同时已有研究表明，含Au NPs的树状大分子纳米材料可诱导巨噬细胞复极化为M1型，在CT成像引导下实现增强的肿瘤免疫治疗。

在众多的纳米平台中，纳米凝胶（NGs）集合了纳米材料和凝胶的双重特性，具有三维网状结构、高水合性、高收缩扩张特性等优点，因此受到研究者的关注。TME响应性（如氧化还原）纳米凝胶一方面通过增强的通透和滞留效应（EPR），高效聚集在肿瘤部位，降低毒性反应；另一方面实现了化疗药物在肿瘤部位的精准释放，减少不良反应。目前在众多的聚合物纳米材料中，第3代聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子（G3.NH₂）具有高度的分支结构和丰富的表面官能团，因此可以作为合成纳米凝胶的一种前体材料。

肿瘤组织丰富的细胞外基质，降低了肿瘤微环境中的血流灌注，最终阻碍药物递送到肿瘤细胞。超声靶向微泡破坏（UTMD）技术利用微泡产生的瞬间空化效应增加血流灌注，使纳米材料在肿瘤部位有效富集。因此，诊疗一体化纳米平台在UTMD技术的联合作用下，可以进一步增强癌症的精准监测和高效治疗。

为实现增强的胰腺癌化学免疫治疗，东华大学史向阳教授团队通过反相微乳液法合成了氧化还原响应型的第3代树状大分子纳米凝胶（G3 NGs），随后负载Au NPs和化疗药物Toy（Au/Toy@G3 NGs），在超声增强的组织穿透力和CT成像指导下，通过靶向肿瘤细胞和免疫细胞的化学/免疫联合治疗策略，实现了肿瘤的高效诊疗（图1）。

图1. Au/Toy@G3 NGs的合成及应用示意图。

研究团队首先通过TEM、UV-vis、粒径和电势变化对NGs的形态、结构和尺寸进行表征，证明Au/Toy@G3 NGs的成功合成（图2a-f）。Au/Toy@G3 NGs在水、PBS以及DMEM中具有良好的胶体稳定性和药物存留稳定性（图2g-h），同时具有对pH和GSH敏感的药物快速释放特性（图2i）。

图2.（a）Au@G3 NGs（比例尺为50 nm）和（b-c）Au/Toy@G3 NGs（比例尺分别代表200 nm和50 nm）的TEM图；（d）G3 NGs和Au@G3 NGs的紫外-可见吸收光谱图；（e）G3 NGs、Au@G3 NGs和Au/Toy@G3 NGs的水合动力学直径；（f）Zeta电位；（g）Au/Toy@G3 NGs分散于水、PBS或DMEM中的水合动力学直径变化曲线；（h）Au/Toy@G3 NGs中的Toy分别在水、PBS或DMEM中的稳定性；（i）Au/Toy@G3 NGs的药物释放曲线。

研究团队通过细胞毒性实验、细胞吞噬实验和细胞凋亡实验验证了Au/Toy@G3 NGs在UTMD的联合作用下，使得癌细胞对NGs的吞噬量增加，从而产生更强的细胞毒性和凋亡作用（图3a-d）。进一步实验结果证明Au/Toy@G3 NGs通过Toy阻断IRE1α-XBP1信号通路，引起的持续性内质网应激放大，介导癌细胞凋亡（图3e-j）。

图3.（a）不同材料处理后Pan02细胞的活力；（b）Pan02细胞在不同浓度Au/Toy@G3 NGs和Au/Toy@G3 NGs + UTMD处理6 h后，对Au NPs的吞噬情况；（c-d）不同材料处理后Pan02细胞的凋亡流式分析和定量分析；（e）内质网应激相关蛋白的Western blot实验结果图；（f-j）不同材料处理后Pan02细胞内相关蛋白的表达水平。

随后，团队通过巨噬细胞转型实验探究基于Au NPs的纳米凝胶对TAMs复极化为M1型的作用（图4a）。通过激光共焦显微镜观察CRT外翻、ELISA实验检测损伤相关模式分子（DAMPs）释放和树突细胞熟化实验探究Au/Toy@G3 NGs产生的ICD效应（图4b-g），证明经纳米药物和UTMD联合处理后可产生明显增强的癌细胞ICD，可诱导树突细胞熟化。

图4.（a）Pan02经不同实验组处理后的流式分析图；（b）Pan02经不同实验组处理后CRT的表达，（c）ATP的分泌，（d）HMGB-1的释放情况分析图；（e）Transwell示意图；（f-g）树突细胞的熟化情况结果分析图。

随后研究团队在小黑鼠体内构建了Pan02皮下瘤模型，验证了UTMD促进的Au/Toy@G3 NGs介导的化学免疫治疗与Anti-PD-L1介导的免疫检查点阻断法相结合产生了最佳抗肿瘤效果（图5a-d）。Au/Toy@G3 NGs + UTMD + Anti-PD-L1在对肿瘤细胞坏死、凋亡（78.2%）和抑制增殖（10.2%）方面的效果最为显著（图5e）。ERS相关蛋白免疫荧光染色结果显示，Au/Toy@G3 NGs + UTMD和Au/Toy@G3 NGs + UTMD + Anti-PD-L1组中的XBP1s下降最显著，而pIRE1α和CHOP可以达到最高的表达水平（图5f）。

图5.（a）Pan02小鼠体内治疗过程示意图；（b-d）治疗后小鼠体重和相对肿瘤体积变化；（e）小鼠肿瘤切片HE、TUNEL和Ki67染色结果；（f）小鼠肿瘤切片XBP1s、pIRE1α和CHOP染色结果。

为了验证联合治疗对小鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响，研究发现Au/Toy@G3 NGs + UTMD和Au/Toy@G3 NGs + UTMD + Anti-PD-L1使TME中的M2型巨噬细胞复极化，M1型巨噬细胞比例升高（图6a）。经流式分析发现，UTMD增强的化学免疫治疗使肿瘤中CD4⁺、CD8 T⁺细胞显著上调，而调节性T细胞（Tregs）表达下调，有效地重新调控免疫抑制性TME，激活小鼠的抗肿瘤免疫反应（图6b-f）。小鼠脾脏部位的CD4⁺、CD8 T⁺细胞免疫荧光染色结果也验证了联合治疗组产生了最强的全身免疫（图6g）。

图6.（a）小鼠肿瘤部位CD86和CD206染色结果；（b）小鼠肿瘤部位CD4⁺和CD8⁺T细胞的分布情况；（c）小鼠肿瘤部位Tregs的表达情况；（d-f）CD4⁺ T、CD8⁺ T细胞和Tregs细胞的表达水平；（g）脾脏CD4⁺和CD8⁺ T细胞的免疫荧光染色结果分析。

简而言之，该研究设计的Au/Toy@G3 NGs具有以下优势：1）通过反相微乳液法形成的杂化NGs，在TME中响应性释放Au NPs和Toy，以提高它们的生物利用度；2）Au/Toy@G3 NGs一方面可通过Toy增强的内质网应激介导肿瘤细胞凋亡和免疫原性死亡，进一步刺激树突细胞熟化，从而激发抗肿瘤免疫反应；另一方面，Au NPs可将TAMs从M2型转向M1型，重新调控免疫抑制TME，在增强抗肿瘤免疫治疗的同时实现肿瘤CT成像；3）UTMD增强的肿瘤渗透和PD-L1抗体介导的ICB，可以实现增强的抗肿瘤化学/免疫联合治疗效果。本研究构建的响应型Au/Toy@G3 NGs在UTMD增强的组织穿透力和CT成像引导下，通过靶向肿瘤细胞和免疫细胞的化学/免疫联合治疗策略，实现了肿瘤高效诊疗疗，为开发新型肿瘤高效治疗纳米药物提供新思路。

以上研究成果以“Redox-Responsive Dendrimer Nanogels Enable Ultrasound-Enhanced Chemoimmunotherapy of Pancreatic Cancer via Endoplasmic Reticulum Stress Amplification and Macrophage Polarization”为题，在线发表于国际著名期刊Advanced Science (DOI: 10.1002/advs.202301759)。东华大学生物与医学工程学院硕士研究生张桂芝为第一作者，史向阳教授、沈明武教授和葡萄牙马德拉大学的João Rodrigues教授为共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委、上海市科委及上海市领军人才计划等项目的资助。

文章链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202301759

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