东华大学曹雪雁副研究员/史向阳教授团队 AHM：恢复巨噬细胞吞噬功能的仿生纳米凝胶用于乳腺癌磁共振成像和化学免疫治疗

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化疗是目前治疗癌症最有效的手段之一，不仅可以直接抑制癌细胞的生长和扩散，还可以通过产生免疫原性细胞死亡（ICD）来诱导抗肿瘤免疫。多烯紫杉醇（DTX）作为许多肿瘤常用的化疗药物之一，具有阻滞细胞周期、激活M1巨噬细胞、诱发ICD等多种功能，但小分子的化疗药物存在靶向不准确、药物耐受性以及副作用严重等问题。另外，肿瘤细胞通过表达相关分子可以逃避免疫细胞的识别与清除，实现免疫逃逸。因此，促进化疗药物的特异性递送和恢复免疫攻击对提高肿瘤治疗效果至关重要。

随着肿瘤免疫逃逸机制的发现，针对负性免疫调节通路的治疗策略也在不断发展。例如，通过阻断PD-1／PD-L1通路可恢复T淋巴细胞活性。除T细胞外，巨噬细胞作为具有吞噬功能的免疫细胞之一，通过呈递肿瘤特异性抗原，在先天免疫和适应性免疫之间起到桥梁作用。然而，癌细胞利用巨噬细胞表面的信号调节蛋白（SIRPα），通过表达CD47产生“别吃我”信号。因此，激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用至关重要。

近期，东华大学曹雪雁副研究员/史向阳教授团队构建了一种恢复巨噬细胞吞噬功能的仿生纳米凝胶，用于乳腺癌磁共振成像和化学免疫治疗。研究团队首先以含大量氨基的PEI为单体，含有二硫键的N,N'-双（丙烯酰）胱胺（BAC）为交联剂，利用迈克尔加成反应，采用反相微乳液法制备了负载超小四氧化三铁（USIO）纳米粒的水凝胶，再利用水凝胶的多孔网络结构物理封装DTX，其次，利用静电吸附作用负载CD47 siRNA，最后通过物理挤压的方式在材料表面包覆4T1癌细胞膜，制得包覆细胞膜且具有GSH响应性的载药纳米凝胶，即DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM（图1）。

材料表征结果表明，所制备的仿生纳米凝胶具有良好的单分散性、胶体稳定性和GSH敏感的药物释放性能（图2）。体外细胞实验结果表明，DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM具有优异的免疫逃逸能力和同源靶向能力，通过DTX介导的细胞周期阻滞，仿生纳米凝胶能够显著诱导4T1细胞发生凋亡和产生ICD，并通过siCD47介导的基因沉默，有效抑制肿瘤细胞上的“不要吃我”信号，进而恢复巨噬细胞吞噬功能（图3-4）。体内动物实验结果表明，DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM能够在肿瘤部位特异性聚集，具有优异的T₁ MR成像效果和化疗效果，同时阻断CD47和PD-L1免疫检查点可以使巨噬细胞重获吞噬活性的同时极大地促进效应T细胞介导的抗肿瘤免疫，并抑制肿瘤肺转移（图5-7）。

简而言之，该研究设计的仿生纳米平台的主要优势在于以下几个方面：1）通过同源靶向和GSH触发的纳米凝胶网络中二硫键的裂解，实现DTX和siCD47的肿瘤特异性递送和响应性释放；2）通过DTX和siCD47的结合，实现了对癌细胞的高效化疗以及增强的免疫治疗；3）纳米凝胶负载的USIO 纳米粒能够在治疗过程中对肿瘤进行精确MR诊断。

图1 DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM的合成路线和体内治疗示意图

图2 （A）USIO@PEI NGs的SEM形貌图及（B）对应的尺寸分布直方图；（C）USIO@PEI NGs的TEM形貌图；（D）DTX、USIO、USIO@PEI NGs和DTX/USIO@PEI NGs的UV-vis图谱；（E）在不同的N/P条件下，siCD47与DTX/USIO@PEI NGs所形成复合物的琼脂糖凝胶电泳图；（F）DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM的TEM形貌图；（G）marker（G-a）、DTX/USIO@PEI NGs/siCD47（G-b）、CM（G-c）和DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM（G-d）的SDS-PAGE凝胶电泳图；（H）DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM在水、PBS以及培养基中的粒径变化曲线；（I）DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM在不同条件下的药物释放曲线。

图3 （A）4T1细胞经不同材料处理后的细胞活力；（B）4T1细胞经不同材料处理后的CLSM图像，标尺为10 μm；（C）RAW 264.7细胞和（D）4T1细胞与不同材料孵育不同时间后的Fe吞噬量；（E）4T1细胞经不同材料处理后的细胞周期分布。

图4 （A）RAW 264.7细胞吞噬4T1细胞的过程示意图及共培养策略示意图；（B）经不同材料处理过的4T1细胞与RAW 264.7细胞共孵育后的细胞总活力；（C）4T1细胞经过不同处理后培养上清液中ATP和（D）HMGB-1的水平；（E）4T1细胞经过不同处理后细胞表面CRT的CLSM图片；（F）4T1细胞和未成熟的树突细胞（iDC）共培养的示意图；（G）树突细胞的流式分析和（H）流式定量图。

图5 （A）DTX/USIO@PEI NGs/siCD47在不同条件下的T₁ MR成像结果和（B）弛豫率r₁；（C）DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM在不同条件下的T₁ MR成像结果和（D）弛豫率r₁；（E）DTX/USIO@PEI NGs/siCD47组和DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM组的体内MR成像结果；（G）肿瘤部位T₁ MR成像的信噪比定量；（H）尾静脉注射DTX/USIO@PEI NGs/siCD47@CM后的不同时间点，荷瘤小鼠的各器官和肿瘤中的Fe含量。

图6 （A）体内治疗过程示意图；经过不同治疗后的（B）小鼠体重、（C）相对肿瘤体积和（D）肿瘤体积；（E）经过不同治疗后肿瘤切片的H&E、TUNEL和Ki67染色，标尺为100 μm。

图7经不同治疗后肿瘤组织中（A）CRT、（B）CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和（C）CD206、CD86的免疫荧光染色结果；（D）经不同治疗后脾脏部位的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和Tregs细胞的流式分析；（E）经不同治疗后小鼠肺部的照片和（F）对应的H&E染色，标尺为5 mm。

以上研究成果以“A Biomimetic Nanogel System Restores Macrophage Phagocytosis for Magnetic Resonance Imaging-Guided Synergistic Chemoimmunotherapy of Breast Cancer”为题，发表于国际著名期刊Advanced Healthcare Materials（DOI: 10.1002/adhm.202300967）。东华大学生物与医学工程学院曹雪雁副研究员和史向阳教授为通讯作者，硕士研究生李路路为第一作者。该工作得到了国家自然科学基金、上海市科学技术委员会等项目的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1002/adhm.202300967

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