LWT：中国农科院张德权和王振宇采用定量磷酸化蛋白质组学分析肌纤维蛋白特定位点磷酸化如何影响肌动球蛋白解离

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中国农科院张德权和王振宇采用定量磷酸化蛋白质组学分析肌纤维蛋白特定位点磷酸化如何影响肌动球蛋白解离

导 读

2020年3月12日，中国农业科学院农产品加工研究所张德权和王振宇等人在LWT-Food Science and Technology（1区，IF：3.714）发表了题为“Quantitative phosphoproteomics analysis of actomyosin dissociation affected by specific site phosphorylation of myofibrillar protein”的研究文章。

该文采用基于质谱的磷酸化蛋白质组学分析了肌动球蛋白解离；肌原纤维蛋白的某些特定位点磷酸化对于肌动球蛋白解离至关重要；肌球蛋白调节轻链的Ser15磷酸化负调控肌动球蛋白解离。

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DOI：10.1016/j.lwt.2020.109269

研究背景： 

保水和多汁是肉的关键品质属性，影响肉品质和消费者的购买决定。肌动球蛋白解离为肌球蛋白和肌动蛋白可以提高持水能力。因此，揭示肌动球蛋白解离的机制是肉类科学研究的重点。一些研究表明蛋白质的磷酸化可以调节肌动球蛋白复合物的形成。然而，蛋白质磷酸化对肌动球蛋白解离的潜在作用机理尚不清楚。

蛋白质磷酸化是调节蛋白质活性和功能的最基本和最重要的机制。蛋白磷酸化调节肌动球蛋白的功能活性，因此在肌肉收缩中起关键作用。尽管已知肌动球蛋白解离会影响肌肉的水分保留，但尚未很好地研究其与蛋白质磷酸化的关系。此外，尽管已经研究了肌球蛋白调节轻链（MRLC）和肌动球蛋白解离之间的关系，但是还没有关于肌原纤维蛋白的磷酸化与肌动球蛋白解离之间关系的系统研究。目前已经认识到肌原纤维蛋白的磷酸化会影响肌动球蛋白的解离，但尚未充分证明其对死后肌中肌动球蛋白相互作用的影响。

研究思路：

该研究旨在探讨肌原纤维蛋白磷酸化和磷酸化位点调控肌动球蛋白解离的机制。基于质谱的定量磷酸化蛋白质组学被用来分析具有不同的肌动球蛋白解离作用的绵羊背最长肌肌肉。研究假设特定部位的肌原纤维蛋白的磷酸化对于在肌肉中观察到的肌动球蛋白解离至关重要。

研究方法：

• 样品采集：选择了五十只绵羊背最长肌（LT）肌肉，并根据死后 48 h的肌动球蛋白解离程度将其分为三组（每组3份LT肌肉样本）：高肌动球蛋白解离组（H），中度肌动球蛋白解离组（M）和低肌动球蛋白解离组（L）。在这项研究中，在死后 48h分析了九个绵羊肌肉。

• 肌动蛋白提取：总肌动蛋白和游离肌动蛋白的提取如先前的研究所述进行（Cao et al., 2019; Gao et al., 2017）。具体见补充材料1。

• 肌动球蛋白解离的测定：根据文献（Okitani et al.，2009），通过SDS-PAGE和western blot测定肌动球蛋白的解离程度。补充材料1中列出了方法的详细信息。

• 肌原纤维蛋白的提取：在死后 48h采用九只绵羊LT肌肉样本进行磷酸化蛋白质组学分析。蛋白质提取是根据之前研究中方法进行（Cao et al., 2019）。具体见补充材料1。

• 超滤辅助样品制备和TMT标记：基于先前的论文进行蛋白质消化和TMT标记（Li et al.，2018）。具体见补充材料1。

• TiO2微珠富集磷酸化：将标记的混合肽溶液冻干，然后溶于500 μL1×DHB缓冲液（0.1％TFA，80％ACN和3％DHB）中。将TiO2微珠添加到重构溶液中，振荡2 h，以5000×g离心1 min，然后弃去上清液。将洗涤缓冲液1（50 μL）添加到Tip column中，然后以3000× g离心3 min。然后采用洗涤缓冲液2（50 μL）清洁Tip column，然后通过以3000× g离心3min，除去残留的残留未吸附颗粒。最后，用缓冲液将磷酸肽冲洗三次，然后以3000× g（3min）离心三次， 然后冻干和MS分析。

• HPLC-MS / MS分析

研究结论：

在具有不同肌动球蛋白解离作用的肌肉肌原纤维蛋白中，共鉴定出来自826个磷蛋白的2073个磷酸化肽。在这些之中，发现来自114种磷蛋白的176种磷酸化肽显著差异地磷酸化。MHC1 的Ser1896，MHC7的Thr1019和Tyr1307，和Titin的Ser265，Ser6085，Ser21930，Ser26576的磷酸化可以抑制肌动球蛋白解离，而原肌球蛋白2在Ser86，Thr252和Ser279的磷酸化有助于肌动球蛋白解离。与肌动球蛋白解离相关的磷酸化位点大多是丝氨酸残基，Ser15的MRLC磷酸化状态与肌动球蛋白解离负相关。

因此，某些肌原纤维蛋白和肌球蛋白在特定丝氨酸残基的磷酸化可能对肌动球蛋白解离至关重要。以上信息可以为进一步研究提高加工肉的持水能力，质地和嫩度奠定良好的基础。

张德权

张德权，二级研究员/博士生导师，中国农业科学院农产品加工研究所副所长。

国家“万人计划”科技创新领军人才、全国农业科研杰出人才、科技部中青年科技创新领军人才、中国农业科学院农科英才B类领军人才，国家现代肉羊产业技术体系加工研究室主任兼岗位科学家，农业农村部农产品加工重点实验室副主任、农业农村部农产品质量安全收贮运管控重点实验室主任、中国畜产品加工研究会副会长、全国畜禽屠宰加工标委会副秘书长、农业农村部农产品加工标委会副主任委员、中国冷链物流联盟副理事长。

主要研究领域：（1）肉品品质、智能化分级分割与物流：重点开展肉品减损保质保鲜理论和智能化分级分割、新型冷链物流关键技术研究，解决生鲜肉加工过程损耗高、品质劣变重的问题。（2）传统肉制品绿色制造：重点开展熏烧烤、风干、酱卤等传统肉制品特征品质保持、加工危害物累积与阻断机理研究，研发绿色制造技术装备，攻克传统肉制品工业化程度低、特征品质保持难的产业共性难题。（3）羊肉梯次加工：重点开展蛋白质修饰及微生物影响羊肉品质的内外源机制、智能分割、绿色保质保鲜、精深加工关键技术研究，创建适合我国饮食习惯的羊肉梯次加工理论、技术、产业体系。（4）肉品营养：重点开展特色畜禽肉营养健康功能成分挖掘、功效评价、新型加工技术研究，开发营养、功能型高附加值新产品。

主持、参加课题情况：主持国家重点研发专项、国家自然科学基金、国际科技合作专项等国家级项目30余项，发表学术论文170余篇，获授权专利57项，软件著作权6项，制定农业行业标准11项。获国家科技进步二等奖、中华农业科技奖一等奖、北京市科学技术奖二等奖、全国商业联合会科技进步奖特等奖等国家级、省部级奖励及个人荣誉13项，主编著作5部，参与起草《全国食品工业“十二五”、“十三五”发展纲要》《“十一五”、“十二五”农产品加工业发展规划》等国家及行业规划8项。指导企业建立示范线55条，直接经济效益160余亿元；培养博士后、硕博士研究生及外国留学生82人，已毕业62名。

资料来源：

http://ifst.caas.cn/rctd/gjzc/zgjzc/208131.htm

王振宇

王振宇，博士，中国农业科学院农产品加工研究所，研究员，全国农产品加工业十佳青年科技人才，入选中国农业科学院“科研英才培育工程”。

主要研究领域：从事传统肉制品加工理论与技术研究工作。（1）特征品质形成与保持：重点开展熏烧烤、风干、酱卤等传统肉制品特征品质解析，加工过程分子互作对特征品质作用机制研究，研创特征品质保持技术；（2）传统肉制品绿色智能制造：重点开展熏烧烤、风干加工过程传质传热与品质控制技术研究，研建固态射频、光波、过热蒸汽、红外等新型热加工技术，创新和集成组装配套的加工装备，实现传统肉制品清洁、绿色、标准、智能加工。

主持、参加课题情况：先后主持或参加国家自然科学基金面上项目、国家重点研发计划等项目研究10余项。发表学术论文30余篇；参编著作3部；获授权国家专利45项；获国家科技进步二等奖、中华农业科技奖一等奖等奖励4项，技术转化企业10余家。

资料来源：

http://ifst.caas.cn/rctd/gjzc/zgjzc/207622.htm

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