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东华大学史向阳教授团队《ACS Nano》:纤连蛋白包覆的含磷树状大分子纳米颗粒通过多重调节骨微环境增强骨关节炎治疗

老酒高分子 高分子科技
2024-09-08
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骨关节炎(OA)导致膝关节疼痛和功能障碍,已成为人类最致残的关节疾病之一,其发展可归因于关节软骨及软骨细胞外基质(ECM)发生降解滑膜炎症以及软骨下骨重塑。活化的巨噬细胞是聚集炎症反应的生物标志物,也是炎症性疾病诊断和治疗的主要靶点。促炎的M1型巨噬细胞极化为抗炎的M2型有效缓解炎症并改善组织修复的策略之一氧微环境可诱导HIF-1α表达上调,影响巨噬细胞极化平衡。病理状态下高水平的活性氧(ROS)往往介导关节炎症的发展,不仅诱导氧化应激和细胞凋亡,还可通过NF-κB信号通路激活M1巨噬细胞极化,加剧炎症反应。因此,清除细胞内ROS和缓解氧可以有效阻断M1表型极化并增强M2表型极化。


适当调节骨免疫微环境(BIM)以促进骨组织修复和再生是逆转OA病理变化的关键措施。M2表型巨噬细胞的转化可以适当调节BIM,参与骨组织的修复和再生促进巨噬细胞和间充质干细胞MSC之间的相互作用,有利于协调骨分化和骨整合过程。因此,开发一种多功能纳米药物通过多角度治疗OA的病理过程有望提高OA的疗效


纤连蛋白(FN)是ECM中的一种主要非胶原糖蛋白,在介导细胞与细胞表面相互作用中发挥着至关重要的作用。他们之前的工作表明,纳米颗粒的FN涂层使其能够特异性靶向高表达整合素αvβ3的肿瘤细胞,从而增强药物传递效率并提高肿瘤的治疗效果(ACS Nano 2022, 16, 984-996)。采用苯硼酸修饰的聚酰胺-胺树状大分子将FN高效递送至肺泡巨噬细胞内,引导脂多糖(LPS活化的巨噬细胞向抗炎M2表型极化,减少促炎因子分泌,增强ROS清除,从而舒缓急性肺损伤的症状(Biomacromolecules 2023, 24, 886-895)。将纳米技术与FN相结合有效发挥FN的抗炎和抗氧化功效,这对促进OA治疗至关重要。


含磷树状大分子具有与蛋白质相似的精确分子结构、理想的刚性和免疫调节活性,已被开发用于增强基因递送、抗肿瘤治疗和抗炎治疗。课题组先前构建了亚磷酸盐修饰的含磷树状大分子胶束用于负载姜黄素,通过整合载体和药物的抗炎特性有效治疗急性肺损伤(Theranostics 2022, 12, 3407-3419)。氮杂双二甲基磷酸酯修饰的第4代磷树状大分子(G4-TBP)具有优异的抗炎作用,通过降低M1型巨噬细胞标志物的表达,阻断NF-κB从细胞质到细胞核的快速易位有效抑制小鼠亚慢性炎症的发展。然而,由于G4-TBP水溶性差且缺乏对巨噬细胞的靶向特异性,限制了其应用范围。


具有ROS响应性的纳米药物制剂如胶束、聚合物纳米颗粒或水凝胶已被开发用于缓释药物并减轻炎症微环境中的氧化应激。此外,采用修饰靶向肽如叶酸、透明质酸或利用细胞膜仿生技术可以使纳米药物靶向至炎症部位,提高生物相容性和延长体内循环时间。因此,构建将G4-TBP和FN负载ROS响应性纳米药物制剂有望通过FN介导的巨噬细胞靶向性能和发挥两者的生物学功能来协同调节骨微环境以治疗OA

为解决以上问题,东华大学史向阳教授团队与法国国家科学研究中心配位化学实验室Jean-Pierre Majoral院士团队合作构建了一种共负载G4-TBP和FN的ROS响应性聚合物纳米颗粒用于OA的抗炎/抗氧化/骨分化联合治疗(图1)。研究团队首先G4-TBP树枝状大分子负载到两亲性嵌段共聚物聚乙二醇-缩硫酮-聚乳酸-乙醇酸HOOC-PEG-TK-PLGA组装纳米颗粒中,进一步将形成的具有羧酸表面的G4-TBP NPs通过酰胺键与FN共价结合,得到G4-TBP NPs-FN。所制备纳米药物在生理条件下稳定,在ROS存在下可以解离释放FN和G4-TBP,并通过FN介导的靶向特异性靶向巨噬细胞,从而显提高FN和树状大分子的生物利用度。形成的G4-TBP NPs-FN在ROS清除、缓解缺氧、M2型巨噬细胞极化、抗凋亡以及为干细胞成骨分化产生有利的BIM等方面发挥综合作用,通过募集骨髓间充质干细胞和成骨分化抑制软骨基质降解和促进软骨修复有效治疗骨关节炎。

 

图1. G4-TBP NPs-FN的制备及其通过巨噬细胞极化、缓解氧化应激和促进干细胞成骨分化用于联合治疗OA。


研究团队首先通过TEM测试了制备的G4-TBP NPs和G4-TBP NPs-FN均呈现球形尺寸分别为218 nm和268 nm(图2A-B)SEM图像显示G4-TBP NPs-FN尺寸为271 nm(图2C)。采用AFM观察G4-TBP NPs(图2D)和G4-TBP NPs-FN(图2E),发现其高度分别为6.84 nm和9.21 nm。SDS-PAGE测试结果表明FN蛋白在G4-TBP NPs上的成功保留(图2F)。G4-TBP NPs-FN在280 nm处出现FN的特征吸收峰(图2G)。粒径和电势的变化进一步验证了G4-TBP NPs-FN成功合成(图2H-I)

 

图2.(A)G4-TBP NPs的TEM图像;G4-TBP NPs-FN的(B)TEM图像和(C)SEM图像;(D)G4-TBP NPs和(E)G4-TBP NPs-FN的AFM图像;(F)G4-TBP NPs-FN的SDS-PAGE分析结果;(G)G4-TBP NPs、FN和G4-TBP NPs-FN的紫外可见吸收光谱;各材料的水合粒径(H)和电势(I)。


研究团队通过细胞吞噬实验证明FN上的RGD序列赋予G4-TBP NPs-FN对巨噬细胞的靶向特异性,可增强细胞对纳米药物的摄取能力。并且,G4-TBP NPs-FN可在LPS刺激的RAW264.7细胞内清除ROS,降低脂质过氧化水平,缓解氧化应激。G4-TBP NPs-FN可提高过氧化氢酶的表达水平,促进在缺氧和LPS环境下RAW264.7细胞中氧气的产生,并降低HIF-1α的表达,有效缓解乏氧。研究团队进一步探究了纳米药物在体外的抗炎和抗凋亡效果。巨噬细胞极化实验显示G4-TBP NPs-FN能够成功诱导巨噬细胞群体从M1表型向M2表型极化,M1标志物CD86和iNOS表达下调,M2型标志物CD206和Arg-1表达上调(图3A-C)。G4-TBP NPs-FN可通过抑制PI3K/Akt和NF-κB信号通路(图3D-E),下调促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的水平,并上调抗炎因子IL-4的表达水平(图3F-H)。此外,G4-TBP NPs-FN可降低巨噬细胞的凋亡率,保护细胞免受LPS诱导的氧化应激和炎症介质的影响(图3I-J)。

 

图3.(A)不同材料处理后RAW264.7细胞表面CD86和CD206表达水平的流式检测结果;(B)不同组RAW264.7细胞M2/M1的比率;(C)不同材料处理后RAW264.7细胞中Arg-1和iNOS的表达水平;(D-E)WB实验分析巨噬细胞p-PI3K/ p-Akt以及NF-κB通路;不同材料处理后,RAW264.7细胞中(F)TNF-α、(G)IL-1β和(H)IL-4的ELISA分析;(I)RAW264.7细胞凋亡情况代表性流式细胞术图和(J)定量分析图。


研究团队发现G4-TBP NPs-FN在体外对巨噬细胞进行有效的免疫调节来实现骨修复所需的抗炎和抗氧化特性,随后探究了这种免疫调节诱导干细胞成骨分化的效果。G4-TBP NPs-FN可提高巨噬细胞中骨形态发生蛋白2(BMP-2)和糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B(GPNMB)的基因表达水平(图4A-B)用G4-TBP NPs-FN及其相应的细胞培养基处理BMSC,发现可提高BMSC中Runt相关转录因子2Runx2和骨钙素OCN这两种典型的成骨相关基因的表达水平(图4C-D)。此外,发现G4-TBP NPs-FN及其相应的细胞培养基处理后的BMSC碱性磷酸酶(ALP)活性最高,并出现显著的矿物质沉积(图4E-F)。

 

图4. 用不同材料处理后RAW264.7细胞中(A)BMP-2和(B)GPNMB的相对mRNA表达的定量分析;与不同材料及其巨噬细胞培养基孵育后BMSCs中(C)Runx2和(D)OCN的相对mRNA表达水平;(E)用不同巨噬细胞培养基培养的BMSC的ALP活性;(F)BMSCs的ALP染色和茜素红染色结果。对于(A-B),Ⅰ,PBS;Ⅱ,LPS;Ⅲ,LPS+G4-TBP;Ⅳ,LPS+FN;V,LPS + G4-TBP NPs-BSA;VI,LPS + G4-TBP NPs-FN。


鉴于G4-TBP NPs-FN在体外表现出良好的抗氧化、抗炎和促成骨活性,研究团队构建了OA小鼠模型进一步评估了其体内治疗功效(图5A)。G4-TBP NPs-FN的生物安全性良好,治疗过程中小鼠的体重持续增加(图5B)。OA诱发的滑膜炎通常伴随着膝关节温度的升高G4-TBP NPs-FN治疗后OA小鼠关节处温度降低图5C-D。通过Micro-CT成像分析软骨下骨的骨形态和骨微结构,进一步验证G4-TBP NPs-FN的治疗效果(图5E)。G4-TBP NPs-FN处理后OA小鼠关节软骨几乎未见病理变化,在所有处理组中骨体积/总体积BV/TV小梁数量Tb.N最高,小梁分离Tb.Sp最低(图5F-H)结果表明,G4-TBP NPs-FN治疗可以有效抑制骨组织的降解,保护关节软骨免受骨侵蚀和破坏。

 

图5.(A)OA小鼠模型的体内治疗方案;(B)不同治疗后正常小鼠或OA小鼠的相对体重变化;(C)健康膝盖或关节炎膝盖经过不同治疗的代表性热成像图像;(D)用不同制剂治疗后健康膝盖或OA膝盖的温度量化;(E)用不同材料治疗后正常小鼠或OA小鼠膝关节的Micro-CT图像;不同组软骨下骨(F)BV/TV、(G)Tb.Sp和(H)Tb.N的定量分析。

研究团队进一步评估关节软骨及其ECM的完整性来评估G4-TBP NPs-FN 的治疗效果G4-TBP NPs-FN组处理后的OA小鼠呈现出完整光滑软骨表面,并且软骨中高表达蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖表明G4-TBP NPs-FN可有效保护软骨免受损伤和降解(图6A)。同时注意到G4-TBP NPs-FN治疗膝关节的滑膜组织和髌下脂肪组织几乎没有炎症细胞浸润,证实了G4-TBP NPs可有效缓解滑膜炎(图6B)。血清中炎症细胞因子TNF-aIL-1β以及MMP-13的水平显著降低,表明G4-TBP NPs-FN可在体内发挥有效的抗炎活性,同时抑制软骨的分解代谢过程,从而保护软骨组织(图6C-E)。

 

图6.(A)不同治疗后健康膝关节或OA膝关节的H&E、番红O和聚集蛋白聚糖染色;(B)不同治疗后滑膜组织和髌下脂肪组织炎症细胞浸润的H&E染色;血清中(C)相对TNF-α、(D)IL-1β和(E)MMP-13水平的ELISA定量分析。


研究团队进一步研究了G4-TBP NPs-FN治疗的潜在机制。体内结果显示,G4-TBP NPs-FN可有效清除ROS,显著降低HIF-的水平以缓解体内氧化应激和乏氧情况(图7A-D)。体内滑膜巨噬细胞的iNOS和CD206免疫荧光染色结果表明,G4-TBP NPs-FN处理后成功诱导M2巨噬细胞极化,有效发挥其抗炎作用,抑制体内滑膜炎(图7E)此外,BMSCs可以被募集到骨组织中并分化为成骨细胞,参与骨再生过程。免疫组织化学染色结果表明,G4-TBP NPs-FN组中CD146(MSC的表面标志物)BMP-2和OCN阳性细胞数量较高(图7F-I),证明G4-TBP NPs-FN治疗可有效募集BMSC用于成骨分化以修复软骨。

 

图7.(A)体内发光图像和(B)不同治疗后小鼠健康膝盖和OA膝盖的相对L-012发光强度;(C)WB分析和(D)不同治疗后小鼠膝关节相对HIF-1α表达;(E)滑膜区域iNOS和CD206蛋白标记物的免疫荧光染色;(F)骨组织中CD146、BMP-2和OCN的代表性免疫组织化学染色。不同处理后(G)CD146、(H)BMP-2和(I)OCN阳性染色细胞的定量分析。


简而言之,该研究设计的纳米药物具有以下优势:1)有效提高了G4-TBP的水溶性和FN的细胞内递送效率,并使含磷树枝状大分子和FN在炎症微环境中响应释放;2)不仅利用FN的RGD序列主动靶向巨噬细胞,而且将G4-TBP和FN各自固有的生物活性充分结合,通过清除ROS和缓解缺氧,有效缓解过度氧化应激并保护细胞免于凋亡,从而抑制关节软骨退化和滑膜炎的发生;3)通过巨噬细胞极化为M2型、骨间充质干细胞募集和成骨分化刺激来调节BIM,进一步促进骨修复和骨整合。所开发的纳米药物制剂结合了生物活性含磷树状大分子和FN治疗OA的优势有望用于不同炎症性疾病的免疫调节治疗。


以上研究成果以“Nanoparticle-Mediated Multiple Modulation of Bone Microenvironment to Tackle Osteoarthritis”为题,在线发表于国际著名期刊ACS NanoDOI: 10.1021/acsnano.4c00909。东华大学生物与医学工程学院史向阳教授为通讯作者,东华大学博士生詹梦偲为第一作者。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、上海市科委等项目及中央高校基本科研业务费专项资金的资助。


文章链接:

https://doi.org/10.1021/acsnano.4c00909


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