技术 | 器官是怎样打印出来的？3D生物打印技术解析

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导语：

3D打印又称增材制造，正在推动如工程、制造、艺术、教育和医学等行业的重大创新。3D打印技术可将生物相容的材料、细胞和相关部件组成复杂的活组织，可被应用于再生医学，以满足对适合移植的组织和器官的需求。

与非生物打印相比，3D生物打印更为复杂：要克服包括材料的选择、细胞类型、生长和分化因子以及与活细胞敏感性和组织结构相关的技术挑战。解决这些复杂问题需要综合来自工程、生物材料科学、细胞生物学、物理学和医学领域的技术。3D生物打印技术先已被用于多种组织的生成和移植，包括多层皮肤、骨骼、血管移植、气管夹板、心脏组织和软骨结构。其他应用包括开发用于研究、药物发现和毒理学的高通量3D生物打印组织模型。

一、3D生物打印的方法策略

1. 仿生学

即对组织或器官的细胞和细胞外成分进行体外复制，复现结构的同时也要保证功能的实现。实现这一过程的关键是成功复制特定组织内细胞的功能成分。因此，在进行体外模拟之前，应该研究清楚微环境中具有功能性和支撑性的不同类型细胞排列、溶质和不可溶分子的浓度区间、细胞外基质的构成和生理状态下的受力情况等各方面因素，而这些又涉及到工程学、图像学、生物材料、细胞生物学、医学等多个领域的交叉研究。

2. 自组装

即利用胚胎作为生物组织复制的原材料。由于发育中的组织的早期细胞可自发地产生细胞外基质（ECM）、适当的细胞信号、自主组织以及模式，可以定向形成所需的生物微结构和功能。这种方法不需要支架，仅使用经过融合和细胞组织的自组装的细胞球体来模拟正在发育的组织。此方法需要对胚胎组织和器官的发生发育机制有深入的了解，并能通过操纵环境来驱动3D生物打印组织中的胚胎生长。

3. 微型组织、器官

微型组织的概念和前面提到的两种3D生物打印方法及其相关。首先，器官和组织是由更小的柔性功能单元或者微型组织构成的。比如肾原可以被定义为肾脏组织内最小的功能单元。这些微型组织可以通过合理的设计和自主装配组成更大的功能组织结构。这其中主要涉及到两种方法，一种是结合生物学设计和结构将自我组装的细胞集团，再次组装成功能性的宏观组织；另外一种是设计并复制出准确、高分辨率的组织单元，然后再自行组装成具有生理功能的宏观组织。比如，各个血管构建模块单元自我组装后形成支血管网络系统。利用3D生物打印可实现功能组织单元的精准复制，再通过微流控系统提供维持功能的养分和信息交换通道的器官芯片，可最终用于体外疫苗、药物的筛选和疾病模型建立。

要打印出具有多种功能、结构及性能的复杂三维生物结构，可能需要结合上述策略的一种或几种。另外，生物打印过程中的主要步骤是模型设计、材料和细胞的选择以及组织结构的打印等。最终打印出来的结构可在体外培养一段时间后移植到体内，或者直接在体外进行下一步分析处理。

典型的3D生物打印过程

二、3D打印过程

1. 医学成像技术与模型设计

复制结构和功能复杂、不均一的组织或者器官需要对其各组成成分的空间结构和排列具有完整全面的认识和理解。医学成像技术可以提供研究对象中细胞、组织、器官和机体水平上的3D结构功能信息。这些技术包括计算机断层扫描（CT）以及核磁共振技术（MRI）等。计算机辅助设计和计算机辅助制造(CAD-CAM)工具和数学建模则用于复杂组织的成像和结构组成信息的收集和数字化。

CT成像基于不同组织对x射线的不同程度地吸收来进行观察和诊断。其原理是X射线源绕着物体旋转，随着X射线穿透人体，传感器测量传输的光束强度和角度，并将数据记录汇编、表示为组织小体积的像素整合。这种成像方式产生紧密间隔的组织结构轴向切片，经过表面渲染和立体光刻编辑，可以充分描述组织的结构。

MRI则可以在软组织中提供较高的空间分辨率，具有对比度强、分辨率高的优点，这对于软组织成像非常有用。原理是利用核磁共振，强磁场使成像组织中的一小部分细胞核与磁场对齐，原子核能量状态的变化产生射频信号，可以用接收线圈测量。

使用造影剂如钡或碘进行CT扫描，使用氧化铁、钆或金属蛋白进行MRI扫描，可以大大提高生物结构的对比度。这些制剂会衰减X射线或增强磁共振信号，而这些信号通常用于突出血管等结构，以增强和周围环境的对比。

2. 具体打印流程及原理

从这些成像方法中获得原始成像数据后，须经过重建处理才能生成二维横断面图像。这个过程被描述为“分析解剖学”向“合成解剖学”的转变。利用CAD-CAM和数学建模技术生成器官或组织结构的三维模型和解剖视图，同时保留可用于体积绘制、体积表示和三维图像表示的图像体积信息。

如果目标是精确复制成像器官或组织，可以直接使用二维横断面或三维模型进行生物打印。直接复制病人自己的器官不太现实(可能会有一定程度的疾病或损伤)，并且代价昂贵，来源有限，很难进行大规模生产。在这些情况下，基于计算机设计的模型将有助于对器官的解剖结构进行设计、分析和仿真。此外，计算机建模可以帮助预测组织结构的机械和生化特性。迄今为止，CT和MRI数据在再生医学中最常被用于提供特定的组织尺寸测量数据，以帮助设计生物打印结构。

将已完成的组织或器官模型与数控生物打印系统相连接，把3D描绘出的模型水平分割成数层2D水平薄片，再输入进3D生物打印系统中。二维水平切片中包含的解剖和构型信息为生物打印设备提供了逐层沉积指令。生物打印技术的不同也会影响组织和器官的设计。比如一些生物打印系统会沉积连续的材料形成三维结构。另外一些系统则会间断不连续沉积多种材料。组织设计者必须考虑到生物打印系统的功能和特性。

单一材料3D打印路径

三维单元结构的多材料打印

三、生物打印主要方式

生物材料的沉积和制版技术主要有喷墨、微挤压和激光辅助打印三种。3D生物打印中最重要的因素，即表面分辨率、细胞活力和打印用的生物材料决定这三种方法的特点。

生物打印的3种方：式喷墨式打印（左）微挤压式打印（中）激光辅助打印（右）

1. 喷墨生物打印

喷墨打印机是非生物和生物应用中最常用的打印机类型。第一个用于生物打印的喷墨打印机是商用的2D墨水打印机的改进版本，墨盒里的墨水被一种生物材料代替，纸被一个升降台控制。现在基于喷墨打印技术的生物材料是专门为处理和打印生物材料而设计的，其分辨率、精度和速度都在不断提高。喷墨打印机将液体滴到基材上，基材可以支撑或成为最终结构的一部分。这种范围在200°C到300°C之间的局部加热对生物分子的稳定性没有实质性的影响，比如DNA分子或者或哺乳动物细胞的生存能力或打印后生理功能。

细胞和水凝胶材料组成的生物墨滴

虽然喷墨打印机打印速度快、成本低、适用范围广。然而，细胞和材料暴露在热应和机械应力下的风险、液滴定向性低、液滴大小不均匀、喷嘴经常堵塞和细胞封装不可靠，这些都是喷墨打印机的缺点。

喷墨生物打印的另一个常见缺点是，生物材料必须是液态的，才能形成水滴。因此，打印出来的液体必须形成一个具有结构组织和功能的立体结构。使用喷墨生物打印技术的另一个限制是难以实现生物相关的细胞密度。通常，低细胞浓度(小于1000万个细胞/毫升)用于促进液滴的形成，避免喷嘴堵塞并降低剪切应力。较高的细胞浓度也可能抑制一些水凝胶的交联机制。

尽管有这些缺点，基于墨汁的生物烧结材料也具有成本低、分辨率高、速度快、与许多生物材料相容等优点。另外，通过改变液滴密度或大小，可以在整个三维结构中引入细胞、材料或生长因子的浓度梯度。由于打印出来呈液滴状，所以更适合于单个细胞连续打印，从而进行单细胞水平上的研究。

2. 微挤压式生物打印

最常见的非生物3D打印机。其中有一些系统使用多个打印头，以方便实现几种材料的连续装配。全球每年销售近3万台3D打印机，学术机构越来越多地购买和应用微挤压技术进行组织和器官的工程研究。虽然价格昂贵，但在打印材料方面有更好的分辨率、速度、空间可控性和更大的灵活性。

微挤压打印机的功能是通过装配在基板上的一个微挤压头来控制的挤压材料的输出。微挤压生产连续的材料而不是断断续续的液滴。在CAD-CAM软件的指导下，将材料的小珠粒在二维空间内沉积，使挤出头沿z轴移动，沉积层作为下一层的基础。用于3D生物打印的生物材料挤出最常用的方法是气动或机械(活塞或螺钉)点胶系统。气动打印机的优点是具有更简单的驱动机构组件，其力仅受系统的气压能力的限制。机械驱动的机构有更小和更复杂的组件，提供更大的空间控制，但会降低承受力的上限。

许多材料都与微挤压打印机兼容，包括水凝胶、生物相容共聚物和细胞球体等材料。对于微挤压式打印机，研究人员经常开发可以热交联和/或具有薄层性能的材料。一些生物相容的材料可以在室温下流动，这使得它们与其他生物成分一起挤出，但在体温下交联成稳定的材料。微挤压系统的高分辨率允许生物打印机精确地制造一些较为复杂的结构，并促进多细胞模式的打印。

不同交联方式

微挤压生物打印技术的主要优点是能够沉积非常高的细胞密度。在组织工程器官中实现生理细胞密度是生物打印领域的一个主要目标。一些研究小组使用仅由细胞组成的溶液，通过微挤压打印技术创建出了一些三维组织结构。尤其是无支架的组织结构进行生物打印最常用的技术就是机械微挤压技术。微挤压生物打印后细胞存活率低于喷墨生物打印。细胞存活率在40%-86%左右，随着挤压压力的增大和喷嘴压力的增大，细胞存活率逐渐降低。微挤压沉积的细胞存活率下降可能是由于黏性流体中细胞受到剪应力的作用。挤压力对细胞活力的影响可能比喷嘴剪切力更大，使用低压和大喷嘴大小虽然可以保持较高的细胞活力，但缺点可能损失其打印的分辨率和打印速度，而维持高存活率是实现组织功能的关键。虽然许多研究报告了打印后细胞存活能力的维持，但重要的是研究人员要证明这些细胞不仅存活，而且在组织结构中发挥其基本功能。

微挤压生物打印已被用于制造多种组织类型，包括主动脉瓣、分支维管树和体外药动学以及肿瘤模型。虽然对于高分辨率的复杂结构来说，制造时间可能会较慢，但已经制造出了从临床相关的组织到微流体室中的微组织等各种结构。

3. 激光辅助生物打印（LAB）

基于激光诱导的正向转移这一原理。激光诱导正向转移技术最初是用来转移金属的，目前已成功地应用于多肽、DNA和细胞等生物材料。虽然不像喷墨或微挤压生物打印那么常见，但正在被越来越多地应用于组织和器官工程研究中。这种打印机的工作原理是利用聚焦激光脉冲在色带的吸收层上产生一个高压气泡，将含有细胞的材料推向下面的集电极基板。LAB的打印分辨率受许多因素的影响，包括激光强度(单位面积的能量传递)、表面张力、衬底的润湿性以及生物层的厚度和粘度等。由于LAB是无喷嘴型的，所以困扰其他生物打印方式的细胞或材料堵塞问题在LAB中可以有效避免。LAB中细胞沉积密度高达108个（细胞/毫升），微尺度分辨率为单个细胞每滴，激光脉冲重复频率为5kHz，打印速度则高达1600毫米/秒。对于细胞打印来说效率是非常高的。

每个打印单元或水凝胶类型通常都需要准备单独的色带，这个准备过程会非常耗时，并且如果多个单元类型和/或材料必须同时沉积，则这些单元的组合打印可能也会非常麻烦。另外，由于带状细胞涂层的性质，很难准确地定位细胞。其中一些挑战可以通过使用细胞识别扫描技术来克服，使激光束能够在每个脉冲中选择一个细胞。这种所谓的“aim-and-shoot”程序可以确保每个打印的液滴包含预先定义的细胞数量。最后，由于印刷过程中金属激光吸收层的蒸发，金属残留物出现在最终的生物打印结构中。避免这种污染的方法包括使用非金属吸收层和修改印刷工艺，使之不需要可吸收层。这些系统的高成本也是组织工程基础研究的一个亟待解决的问题，但是与其他3D打印技术一样，这些需求成本正在随着科研技术的发展而迅速下降。

体内LAB的应用试验已经用于在小鼠颅骨三维缺陷模型中进行纳米羟基磷灰石的打印沉积中。另外，激光3D打印已经被用于制造医疗设备，比如定制的、非细胞的、生物可吸收的气管夹板，相应产品已经被植入一名患有局部气管支气管软化症的年轻患者体内。未来的研究可能会使用可以直接整合到病人组织中的生物相容性材料。

结语：

3D生物打印组织结构不仅可以用于移植，而且还可以用于新型药物的发现，化学、生物和毒性分析以及相关的基础研究。随着研究人员不断提高打印组织的复杂性，从二维组织，如皮肤，通过中空的管道如血管，中空的非管状器官如膀胱以及整个器官如肾脏，这方面的研究工作者将不得不应对日益艰巨的挑战，包括细胞和材料的需求，组织的生长和功能，以及适当的血管化和神经支配等要求。这些挑战需要多学科交叉的研究来应对，3D生物打印技术将具有改造再生医学领域发展速度和深度的无限潜力。

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作者 Viki  |  编辑 王卓逸  |  排版 墨非

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