CRISPR技术与iPSC，聚是一团火，散是满天星！ | 医麦猛爆料
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利用这套在人类iPSC分化的神经元中进行基于CRISPR干扰（CRISPRi）的高通量遗传筛选技术，研究人员首先进行了大规模筛选，并且惊讶的发现且鉴定出了特异性影响神经细胞存活的基因（“管家”基因）。
另外，为了探明机制，作者通过CROP-seq（CROP-seq是一种结合了CRISPR筛选与单细胞转录组测序的技术，它可以让我们鉴定出每个细胞中所表达的sgRNA，以及敲低这个sgRNA对应基因对这个细胞转录组引起的变化。）发现了敲低这些基因所引起的神经细胞特异性的基因表达变化，并通过阵列式的长期成像（arrayed longitudinal imaging）手段观察到这些基因对于神经元形态的影响。
这一技术可以被利用到筛选其他神经功能或神经疾病相关表型的基因，同时，由于这个平台是建立在干细胞中，所以其应用不只局限于神经细胞，而可以被应用到各种各样的不同细胞种类中。总之，这一技术为系统性阐述人类基因在不同细胞类型中的功能提供了有效的途径。
▲图片来源于该文献
CRISPR技术与iPSC的结合
2006年日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）用逆转录病毒将四个转录因子（OSKM）引入特化的成体细胞，成功诱导它们去分化成多能干细胞（iPSC）。这些细胞在实验室中表现出与胚胎干细胞相当的能力，又避开了胚胎干细胞的伦理问题，在疾病模拟、药物筛选和细胞治疗中有着巨大的应用前景，被人们视为细胞疗法的新希望。山中伸弥也因为iPS技术赢得了2012年的诺贝尔生理/医学奖。
CRISPR是指规律成簇的间隔短回文重复，细菌通过CRISPR与内切酶Cas9组成的防御系统对抗外来侵略者。CRISPR-Cas9能根据向导RNA的指引切割入侵者的遗传物质。2012年研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。此外，研究者们还在CRISPR的基础上开发了调控基因表达的新工具，CRISPR干扰（CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPRa）等。
CRISPR基因编辑和iPSC重编程是生命科学领域近年最热门的两大技术。人们普遍认为，iPSC与CRISPR的结合会起到一加一大于二的效果。比如，CRISPR用于人类iPSC可以揭示基因在特定疾病中起到的作用，甚至可以校正患者细胞的基因缺陷。虽然CRISPR-Cas9和人类iPSC在实验室中已经相当普及了，但二者相结合并没有想象中那么容易。The Scientist杂志与多位正在使用这两个工具的专家联系，推出了在人类干细胞中使用CRISPR的基础指南。这份指南对人iPS和人胚胎干细胞同样适用。
科学家们很快发现，CRISPR系统的DNA切割机制，一种叫做Cas9的酶，与iPSCs无法良好混合。这次在《Neuron》上发表的这篇文章的通讯作者、加州大学旧金山分校神经退行性疾病研究所副教授Martin Kampmann博士表示“干细胞具有非常活跃的DNA损伤反应。当Cas9产生甚至只有一到两次DNA切割时，它会导致细胞死亡。”这是一个长期以来一直困扰着科学家的问题。
为决定解决这个毒性问题，Kampmann等开发了一种修饰过的CRISPR技术（CRISPRi工具），其中Cas9酶已经失活。当CRISPRi找到它正在寻找的基因时，它会在不进行任何切割的情况下抑制其活动。因此，与标准CRISPR-Cas9不同，CRISPRi可以靶向并干扰基因但不会对iPSC或干细胞分化的神经元产生毒性。
CRISPR技术与iPSC之于神经退行性疾病
神经系统疾病的治疗通常是临床医学工作者最受困扰的医学难题之一，因为许多神经系统疾病是由于神经细胞丢失或功能退化造成的，目前的药物治疗手段难以使神经细胞功能再生，成熟的神经细胞又很难分化并替代丢失的细胞。
并且，随着人类预期寿命的增加，患有神经退行性疾病（ND）的患者数量正在迅速增长。尽管许多学者致力于研究神经退行性脑疾病的发病机制和进展，且科学家们都知道突变和其他遗传变异与许多神经系统疾病的风险增加有关，但技术瓶颈限制了科学家们对实验室中人类神经元展开深入探索，无法了解这些基因究竟是如何引起疾病的。由于很难早期诊断疾病，因此要开展实际治疗仍有太多工作。近年来CRISPR技术和干细胞技术的发展给这个疾病带来了一些不一样的希望。
“该领域面临的一大挑战是，对于大多数这些疾病，我们对药物开发的精确分子途径仍不了解，”此次发表的文章的另外一位作者，来自美国国立卫生研究院(NIH)的Michael Ward博士说。
直到最近科学家们还没有可靠的方法获得可以用于高级实验室实验的人脑细胞。Kampmann博士说：“接受过脑组织切除以治疗癫痫或脑癌的患者捐献神经元是一种可能的途径，但这些样本只能存活几天，无法进行实验来探测活着的神经元的基因功能。”因此科学家通常依赖于脑疾病的动物模型，但这种模型无法捕捉到人类神经生物学的许多细微差别。
“通过这项技术，我们可以从患有阿尔茨海默症等神经退行性疾病的患者身上获取皮肤或血细胞，将其转化为神经元或其他脑细胞，找出哪些基因控制与该疾病相关的细胞缺陷，”Kampmann还表示，“这些信息可能使我们能够确定有效的治疗目标。”
在这一方面，国内上海捷易生物科技有限公司（Shanghai Gemple Biotech Co.Ltd）专注于新一代技术在疾病的临床检测以及科研转化两大领域的产业化应用。在遗传及遗传相关疾病科研转化领域，捷易首次提出从诊断到疾病建模，再到转化研究的全新一站式遗传病整体解决方案，为遗传病的精准治疗提供更多机制性证据，最终帮助医生和患者寻找更多的治疗上合理方案。
该公司立足于国内外临床和科研人才团队，拥有独特的技术解决方案，即：以高通量测序为主多技术基因检测平台，完整的CRISPR/Cas9基因编辑技术平台，以及iPSC技术平台。并将CRISPR技术与iPSC结合为多种疾病的药物开发提供可能的靶点。
结语
将CRISPR应用到iPSC细胞中去，除了为探索疾病机制，研究药物靶点提供了有力的支持，还可以实现个性化的干细胞治疗，造福多种遗传学疾病的患者。总之CRISPR技术和iPSC这两大热门技术不仅能在自己的领域发光发热，协同合作的潜力更是令人惊讶。在未来，这些先进的技术将如何改变现有的疾病治疗方式，我们拭目以待。
2.The Scientist杂志发表：Using CRISPR to Edit Genes in Induced Pluripotent Stem Cells
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