为期十年的预装层析柱性能参数趋势分析
来自奥地利工业生物技术中心等的研究人员在《Journalof Chromatography A》杂志上发表了题为“Trend analysis of performance parameters of pre-packed columns for protein chromatography over a time span of ten years”的文章。文中，研究人员使用先进的统计工具，对10年内交付给客户的30,000根预装层析柱的装柱质量进行了分析。分析中，首先提取并检查数据的非一致性，然后制表并使用编程语言Perl（https://www.perl.org）和统计计算环境R（https://www.r-project.org/）进行统计处理。HETP和不对称性按时间绘图，以获得10年内的装柱质量趋势。获得的数据用作可视化变异系数分析（VCVA）。降低的HETP呈现典型的波动，但在这些预装柱中，没有观察到生产过程中的海啸效应，即生产偏差的传播导致产品规格超标的效应。数据分析结果显示，目前用于生物药生产的商业层析介质可高重复性、均一地装填至基于聚合物的、以即取即用为设计目的的预装层析柱，且虽然装填的预装柱数量在十年内翻了两倍，但是装柱质量仍保持稳定。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
预装层析柱，或称“即取即用型”实验室层析柱，已经上市十多年，且在工艺开发和设计空间的“后验评估”中非常受欢迎。此类层析柱可用于降低非常繁琐的装柱操作的时间。节约时间对于生物制药行业来说非常关键，这也是预装柱得到广泛应用的原因。一般，行业内认为预装性能不会随时间发生变化，并可生产性能一致的产品批次。对于即取即用的可抛弃型层析柱，其结构必须简单、便宜，一般不装配成本较高的可调活塞，如适配器。所以，层析柱内必须精确装填准确量的层析介质，这需要一定装柱专业知识和技能。装填的层析柱的性能通常在销售前由生产商进行检测。通常，客户假定所有即用型层析柱具有相同的装柱质量，不需要重新检测装柱质量即可应用。本文分析即为确认此观点而进行。
原则上，层析介质可按骨架进行分类：1）天然聚合物，如琼脂糖或葡聚糖；2）合成聚合物，如丙烯酰胺或聚甲基丙烯酸酯；以及3）无机材料，如硅、羟基磷灰石或控制孔隙度的玻璃。已经有很多方法被介绍用于不同骨架性质介质的层析柱装柱，但装柱程序对小规模层析柱装柱质量的影响尚不完全了解。相比刚性颗粒或软材料，如SephadexG-25或Biogel，半刚性层析材料更容易装填。在流动条件下的浆料装柱（流动装柱）通常用于基于软质天然和合成聚合物的层析材料的装填。层析柱在比分离应用更高的流速和压力条件下装柱。刚性颗粒通常为干包装，但这取决于其颗粒粒径。基球装入层析柱并被压缩，这一过程称为轴向压缩，其也可以应用于浆料装柱，但不适合用于即用型层析柱，因为活塞不是该类层析柱结构的组成部分。装柱过程中，层析柱的振动有助于提高装柱密度，该技术已被成功实践应用了多年。
用于控制所有规模层析柱装柱质量的标准参数是HETP（理论塔板高度）和不对称性。HETP是一个与柱长无关的参数，其取决于实验所用的颗粒大小、孔径、孔径分布、颗粒孔隙度、速度以及溶质。当使用小分子示踪剂测试专用于蛋白质溶液的材料时，空隙、孔径、孔径分布或颗粒孔隙度就不那么重要了，因为分子具有非常高的有效扩散率。不对称性是另一个用于对装柱质量进行定量的良好参数，因其可指示接近柱壁的装填密度比柱中心密度高还是低。检测HETP和不对称性的实验条件必须根据溶质和流速进行标准化。众所周知，峰拟合方法可能会影响结果，如图形化峰积分、数值积分或通过模型函数的拟合峰以及基于模型的变量和保留时间计算。除了实验条件外，数据评估必须高度标准化，以比较不同实验之间的装柱质量。
为了观察材料性能的变化趋势，可以进行简单的趋势分析。一种简单但非常有效的方法是绘制随时间变化的属性图，使变化可视化。数据的变化可通过主成分分析来评估，其可帮助区别协方差。实验收到了~30,000份即用型层析柱装柱实验的性能数据。设计用于纯化蛋白质和其它生物大分子的不同层析介质在标准条件下装柱。对于每种介质，最佳的装柱程序由装柱公司开发。装柱质量通过注射丙酮并根据峰形图确定保留时间和峰宽度进行检测。相同的程序在约10年的整个生产周期中使用。由于孔径较大，测试实验选择注射一种小示踪分子，只测定水动力弥散。这种分散性只受装柱质量和柱外分散性的影响。
统计分析中装填数量最多的30种层析填料（T.Scharl, et al., 2016）。
本研究最大的一个挑战是如何从层析柱检测中提取大量的实验数据。一个专利的闭源软件（Eurochrom）最初被用于测试层析柱并储存相应的结果。EuroChrom以二进制形式储存数据，并且不提供其它程序访问数据的API（应用程序界面）。所以，层析柱数据只能通过Eurochrom的GUI（图形用户界面）来检索。对于少量样品，手动输出是可能的。但是，手动导出储存在550个Eurochrom数据库、分布在53.5万个二进制文件上的3万个测试运行文件将是一个非常耗时且容易出错的工作。因此，用编程语言Perl编写了一个计算机软件程序，其使用Win32:GuiTest模块模拟鼠标事件和人类计算机用户的点击行为，利用Eurochrom的GUI自动检索十年间生成的层析柱测试数据。提取后，将数据读入统计计算机环境R（https://www.r-project.org/），对数据进行进一步的处理、汇总和可视化。利用主成分分析寻找数据最大的变化方向、可视化数据结构并检测离群值。
10年内24,626根即用型预装层析柱的HETP变化趋势，虽然略有变化，但是h值总是在5以内。对于蛋白质层析的目的用于，h值在3-15范围内，即可认为层析柱装填良好（T.Scharl, et al., 2016）。
预装层析柱不对称性的变化趋势，显示在10年内该性能参数保持稳定（T.Scharl, et al., 2016）。
主成分分析（PCA）用于确定影响装柱质量的变量。变量降低的HETP（h）、不对称性、颗粒大小、柱长度以及直径的方向以蓝色箭头标示，点离中心越远，说明该参数对结果的影响越大。PCA显示，所有装柱材料良好聚集（T.Scharl, et al., 2016）。
详细分析方法和结果，请参考原文。
对不同即用型层析柱的质量参数，降低的HETP和不对称性，的统计评估显示，层析柱装填良好。降低的HETP的变化略高于不对称性的变化，其主要受层析柱几何结构和设计的影响。功能模式不受装柱质量的影响。分析也观察到了装柱质量与填料骨架组成的关系，且随着层析柱尺寸的增加，不对称性略有降低。
Schure等的理论分析认为，对于装柱程序，相比以达到最高的装填密度为目标，防止可能导致不均一装填的缺陷点的形成更为重要。Guiochon等也总结认为，良好装填的层析柱应不仅是最佳装填，更应该是可重复的装填。从这点考虑，研究的10年内装填的此高数量层析柱具有令人印象深刻的良好装柱性能。总结来说，自此类即用型预装层析柱商业化以来的十年内，针对其目的用途，可确保可重复的装柱质量。
原文：T.Scharl, C.Jungreuthmayer, A.Durauer, et al., Trend analysis of performance parameters of pre-packed columns for protein chromatography over a time span of ten years. Journal of Chromatography A, 2016, 1465: 63 - 70.
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