核酸检测的原理是什么？为什么会有假阳性和假阴性？

想要了解新冠疫情的情况并控制疫情发展，很重要的一点是区分感染者与非感染者，而判断是否感染病毒的最重要的检测手段，就是基于聚合酶链反应（PCR）的核酸检测。核酸检测的原理是什么？为什么会存在假阳性和假阴性呢？

PCR是一种大量扩增特定DNA（脱氧核糖核酸）序列的技术，该技术研发于1985年，现已广泛应用于生物学、医学、环境学、农学等研究领域。发明PCR的美国生物学家凯利·穆利斯（Kary Mullis，1944～2019）凭借这一成果获得了1993年的诺贝尔化学奖。

图1.该照片于 2020 年 3 月 3 日拍摄于德国莱比锡圣乔治医院（St. Georg Hospital）的中央医学实验室。

由熟练的工作人员按照流程来操作的话，PCR并不复杂，即使是极微量的DNA也能被大量扩增，是非常有效的病毒检测手段。

核酸检测中使用的样本（患者体液等）是医生用棉棒（鼻咽拭子）擦拭患者的鼻腔和咽喉，并用药剂适当处理后装入标本管得到的。这样的样本保存于特定温度下，迅速被送到检测机构，在那里进行核酸检测。

下图展示了DNA是如何通过PCR扩增的。

图2.使用 PCR 扩增 DNA 的机制

新型冠状病毒的PCR检测流程如下所示（1～9）。上图展示了其中步骤4～8。

1.从被检测者的鼻腔、咽喉和痰液中采集样本。

2.从样品中提取RNA。

3.使用特定的酶（逆转录酶）将RNA逆转录为双链DNA。

4.加热双链DNA，使其变性为单链。

5.加入开启DNA扩增的碱基序列（引物），引物与单链DNA结合。

6.特定的酶（耐热性DNA聚合酶）发挥作用，延长引物合成DNA。

7.完成后，得到两个双链DNA。

8.在调控温度的同时重复步骤4～7，继续扩增DNA。根据分析方法的差异以及缓冲液、引物、分析设备的类型，所需重复次数有所不同。

9.确认来源于新型冠状病毒的DNA扩增情况。若电泳（利用电压按分子量大小分离DNA和蛋白质等物质）结果观察到新型冠状病毒独有的特征，或者在计算机分析数据时观测到增幅曲线上升（见图3），则判断为“阳性”。

普通的PCR是将步骤4至步骤7作为一个周期对DNA进行反复扩增。但是，由于冠状病毒的遗传物质并非DNA，而是RNA（核糖核酸），因此需要先将RNA转换成DNA才能进行扩增。这种方法被称为“逆转录PCR”（RT-PCR）。

▼若观测到曲线上升，则判定为阳性

图3.使用实时 PCR 的结果示意图，借助曲线上升判断病毒遗传物质是否扩增。图中所示曲线为阳性，说明样品中存在病毒。如果是阴性，则曲线不超过阈值。

目前，可实时确认DNA扩增量的“实时PCR”（realtime PCR）已广泛应用。将逆转录PCR和实时PCR结合到一起的方法被称为实时逆转录PCR（realtime RT-PCR），此次新型冠状病毒的检测中使用的就是这种方法。如果实时看到样本中新型冠状病毒相关的序列被大量扩增出来，则确认是阳性（图3）。

关于检查结果的可靠性（置信度），一般使用“灵敏度”和“特异度”这两个统计指标来评价（见下表）。

▼检查精度中的“灵敏度”和“特异度”

根据是否感染和检查结果，可分为“真阳性”“假阳性”“真阴性”“假阴性”这 4 类。

灵敏度是指“感染病毒的人被正确判定为阳性的概率”，特异度指的是“未感染病毒的人被正确判定为阴性的概率”。受到病毒、细菌种类以及检查环境等影响，这两个指标的概率都不会达到100%。对一般的检查而言，灵敏度达60%～90%、特异度达80%～95%就可以认为是合适的。

本文选编自《科学世界》2020年第5期

撰文 / 西村尚子 铃木彰容

翻译 / 王凯文

新媒体编辑 / 张丽君

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