用于抗体纯化的高通量工艺开发工作流
来自英国伦敦大学学院和MedImmune公司的研究人员在2019年第1596期的《Journal of Chromatography A》杂志上发表了题为“High throughput process development workflow with advanced decision-support for antibody purification”的文章。文中，研究人员指出，层析目前仍然是抗体纯化的主要方法，但是，工艺开发和表征需要大量的资源。传统上，大量的操作参数需要在小规模和中试规模条件下进行大量的实验，其所需要的材料和时间是一个不小的挑战。据此，原文研究的主要目标是建立一种新型的高通量工艺开发（HTPD）工作流，将规模缩小层析实验和先进的决策支持技术相结合，以最大限度地减少资源消耗，加快开发进度。此外，HTPD工作流为以自动化方式快速地操作大型数据包提供了一个框架。HTPD工作流的核心组成是微量规模层析实验策略与先进的色谱图评估方法、实验设计（DoE）以及多变量数据分析的系统性整合。方法的输出结果被用于筛选和优化工作流。对于筛选部分，研究人员开发了一种结合不同多标准决策技术的决策支持工具，用于多个阳离子交换（CEX）填料候选物的公平比较，并确定哪些填料具有更出色的纯化性能，这为筛选层析填料和工艺参数提供了一种合理的方法。对于优化部分，工作流利用通过筛选实验获得的结果，指导后续的DoE实验，从而调整所选填料的重要工艺参数。由此产生的经验相关性与随机建模技术相联系，以预测最佳且最稳健的层析工艺参数，达到所需的性能标准。
本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
在生物药生产中，层析纯化工艺的开发仍是一项极具挑战且复杂的工作，特别是在早期阶段。由于大量的参数可能会对层析分离的性能产生潜在的重大影响，传统上，需要在实验室规模条件下进行大量的实验，以优化操作条件，而大量的实验即意味着需要大量的澄清物料以及较多的时间。高通量实验（HTE）是一种强大的技术，其可使用相对较少的原料，而加快工艺开发。但HTE需要高通量的分析方法以及数据操作和分析工具的开发，以处理大型数据包并更充分地利用获得的信息。研究的总体目标是建立一种用于治疗性抗体纯化的合理的系统性高通量工艺开发工作流，其将整合决策支持技术，以更好地利用高通量纯化数据。
当前，监管机构提倡质量源于设计（QbD）和过程分析技术（PAT）的应用，这促使生产商在工艺开发和优化中采用更加系统性的方法，以定义设计空间，确定关键工艺参数对关键质量属性的影响。纯化工艺的开发可使用不同的策略，包括在硅方法（in silico，计算机模拟方法，译者注）和实验性实验室方法。在硅方法包括启发式或基于知识的方法，以及基于算法和模型的方法。实验室方法通常依赖于高通量实验方法。也有文章提出了结合高通量实验和不同在硅方法的混合方法。
目前市面上有三种可用于层析高通量实验的微量规模产品：1）微升批次孵育，2）预装的微量移液层析吸头以及3）预装的微型层析柱。已有不少文章基于不同的目的测试研究并比较了不同的方法。但从几何结构和液流特性考虑，柱床体积为50-600 μL微型层析柱可能可更好地代表工业使用的装填柱床层析柱。有研究认识到了对更快速的分析工具的需求，所以使用这种微型层析柱，结合自动液体处理系统和分析系统，评估了多种不同层析填料从宿主细胞蛋白中纯化单克隆抗体的能力。
层析工艺开发的另一个选择是将高通量实验与其它不同的方法相结合，包括将高通量实验与遗传算法或机械建模相结合，以优化层析操作的工艺参数。混合方法的优点是可将不同的方法联系起来，突出优点，并弱化每种方法的局限性。
除了工艺参数优化外，在早期工艺开发阶段的另一个重要决策是纯化流程中，以正确次序组合的每个步骤的合适填料的选择。考虑到不同的填料有较宽的操作范围以及大量需要筛选的工艺参数，填料的选择是一项相当复杂的任务。
混合方法有助于填料选择以及工艺参数的优化，其将高通量实验与基于模型的优化形式相整合。将高通量实验整合到结合了不同工具和方法的平台中来，以形成高通量工艺开发策略，是一个非常有意思的趋势。通过针对QbD的倡议，监管机构建议生产商采用高通量工艺开发策略，以从产品生命周期的极早期阶段，加快工艺开发，达到高水平的产品和工艺了解。
过往的研究主要关注于单个技术，将规模缩小实验与DoE、MVDA和决策工具相整合的完整工作流的案例很少。此外，与高通量实验相关的进一步挑战是如何最好地利用所产生的大量原始数据，以对数据包进行权衡评估，做出最佳策略的决策。本研究工作意识到了时间和物料的局限性，所以主要关注以半自动化方法，结合多种不同方法的高通量工艺开发工作流的建立，以使不同阳离子交换（CEX）层析填料的筛选以及在不确定性条件下工艺参数的优化更加简单。
用于以结合-洗脱模式进行的层析操作的高通量工艺开发工作流的示意图（C.Stamatis, et al., 2019）。
研究的总体目标是确定实验方法与决策支持技术的合理组合，以为层析纯化数据的快速生成和分析提供一种一致的方法。研究以单个层析步骤为例，而不是完整的纯化流程，以便获得可能影响每种填料候选物性能的工艺参数的详细情况。研究提出的高通量工艺开发工作流建议使用以自动化液体操作系统操作的微型预装层析柱，以快速获得纯化数据。此外，引入DoE与分馏图方法的整合，以处理高通量实验生成的大量数据，并建立了多变量数据分析、多标准决策以及稳健性分析方法，以确定高聚集性抗体溶液层析纯化的潜在操作窗口。
材料和方法
实验使用一种双特异性抗体，用于证实高通量工艺开发工作流的执行。产品以CHO细胞生产，细胞培养液使用深层过滤澄清，并进一步使用Protein A层析柱纯化，之后低pH灭活囊膜病毒，料液中和后，用于CEX层析研究。抗体使用切向流过滤浓缩。
高通量实验使用自动化液体操作系统Freedom EVO® 200 (Tecan) 和预装200μL或600μL CEX填料的RoboColumn®微型层析柱(Repligen)。筛选研究使用8种CEX填料：PorosTM XS 和 PorosTM HS50 (Thermo Fisher)、Toyopearl® GigaCap S-650(S)和ToyoPearl® GigaCap CM-650(M) (Tosoh)、CaptoTM S Impact(GE Healthcare)、Fractogel® EMD COO-(M)和Eshmuno® CPX (EMD Millipore)以及UNOsphereTM Rapid S(BioRad)。实验室规模验证实验在AKTATM Avant 25层析系统上进行。使用UV/Vis光度计检测浓度，使用UPLC及SEC柱检测聚体、产物和片段。
开发的填料选择工具的可视化图，用于确定满足所需决策属性的CEX填料。用户规格定义决策属性的优先级顺序。用满足法确定所获得的属性。每种填料候选物结合其各自的属性归一化值，分配一个性能分数。排名首先考虑填料候选物所获得属性的最高数值，然后考虑其性能分数。表中所示为每个工艺参数的设定点（C.Stamatis, et al., 2019）。
更多详情的实验设计及分析方法和结果，请参考原文。
总结
研究证实了一种新型高通量工艺开发（HTPD）工作流的执行，用于高聚集性双特异性单克隆抗体的层析纯化。HTPD工作流将微量规模的高通量实验（HTE）与实验设计（DoE）、回归分析、多参数决策以及随机分析相联系。HTPD工作流的一个主要关注点是建立用于提供方法和工具的系统性框架，以处理HTE获得的大型数据包，并实现绝大部分数据操作和分析的自动化。从HTPD工作流执行中获得的知识可进一步用于指导更大规模的实验，以建立设计空间和控制策略。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：C.Stamatis, S.Goldrick, D.Gruber, High throughput process development workflow with advanced decision-support for antibody purification. Journal of Chromatography A, 2019, 1596:104-116.
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