基因治疗时代人物威尔逊：20年致力于安全病毒载体的研究，他见证了低沉到华丽回归
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2019年9月17日/峰客访谈 FENGClub/--1999年9月17日，杰西·盖辛格(Jesse Gelsinger)在宾夕法尼亚大学詹姆斯·威尔逊(James Wilson)实验室接受实验性基因疗法后去世。
时隔20年后的今天，基因治疗领域正以闪电般的速度发展。随着欧盟、美国对几款基因疗法的批准，以及更多有希望的临床数据公布，该领域的活力大大增强，不久前很难筹集的资金大量涌入学术实验室和开发基因疗法的公司。
美国FDA正在目睹一系列细胞和基因治疗产品进入早期发展阶段，它预计明年将收到超过200个新的细胞和基因疗法的临床试验申请。
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对于那些在过去30年中经历过基因治疗的高峰和低谷的人来说，这种起伏既令人兴奋又焦虑。在该领域的所有先驱者中，64岁的威尔逊可能比任何人都更加强烈地感受到紧张，他的个人经历也仿佛是基因治疗领域发展过程中的一个缩影。
华丽回归
在概念上，基因疗法很简单：由于遗传性疾病是由错误基因引起的，因此给患者提供该基因的功能性副本可以提供一次性修复。挑战实际上是将治疗基因带入体内。威尔逊和其他人将它们塞进了掏空的腺病毒中 - 这些腺病毒天生擅长渗透细胞以繁殖自己的基因。
▲杰西·基辛格（图片来源：nikest.com）
二十年前，杰西·基辛格注射了威尔逊实验室设计的大剂量携带校正基因的腺病毒(Ad)，以治疗罕见的代谢性肝病——鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症。治疗4天后，基辛格由于强烈的免疫反应导致多器官衰竭和大脑死亡。
这使得热火朝天的基因治疗领域迅速冷却。随着关于基辛格死亡的细节的出现，整个基因治疗领域开始崩溃。投资者资金枯竭，初创公司关闭。
基辛格家族提起诉讼(威尔逊成立了一家名为Genovo的生物技术公司，该公司为宾大研究所提供资金，领导临床试验，并拥有将其发现商业化的权利。这种联系助长了关于威尔逊为了获利而肆无忌惮地行事的指控)。威尔逊发现自己处于多重调查的中心。他被剥夺了头衔，他领导的基因治疗中心被解散，他被禁止在2010年之前进行任何临床试验。
尽管如此，或许也正因为如此，威尔逊缩小了实验室的规模，并把精力放在寻找更安全的病毒上。他们的工作促使了新型腺相关病毒(AAV)的发现和传播，包括最近批准的基因疗法Zolgensma中使用的AAV9，它可以挽救出生时患有致命神经疾病的婴儿的生命。
Zolgensma只是一个开始。根据宾大的最新统计，约有42家公司正在使用属于威尔逊专利的AAV，涵盖近100个药物开发项目。其中11家公司已从Regenxbio获得许可，Regenxbio是威尔逊于2009年共同创办的一家公司，旨在将其技术商业化。
这是威尔逊的职业生涯和基因治疗领域的华丽回归。有人称赞他促成了该领域的复兴，但也有人指责他导致了该领域在20年前几近消亡。但有一件事是确定的——基因疗法又回到了商业领域。
寻找新的、更安全的基因递送病毒
在OTC试验开始之前，威尔逊的实验室就一直在努力控制实验动物对病毒的免疫反应。这种疗法的的一次迭代甚至导致猴子在高剂量下死亡，因此威尔逊让其团队成员高光坪(现任麻省大学基因治疗中心主任)开发一种受损的腺病毒，这种病毒可以递送基因，但不会触发免疫系统的T细胞攻击肝脏。
然而，当杰西的身体在注射腺病毒后的一天内开始崩溃时，威尔逊知道T细胞不可能是罪魁祸首，因为它们需要一周或更长时间才能发动攻击。问题似乎出在我们身体防御的一个不同分支——先天免疫系统。
威尔逊的研究小组从未考虑过先天免疫系统会带来问题，也没有确定的方法来重新设计腺病毒。在这种情形之下，威尔逊的任务是找到更安全的基因递送载体，这些载体不会点燃先天免疫系统。他制定了一个计划，把他实验室的剩余部分改造成一个发现商店，但他需要钱。
当威尔逊陷入争议时，威尔逊的老导师、当时是SmithKline-Beecham(现为GlaxoSmithKline)首席科学官的Tachi Yamada鼓励他继续研究工作。2000年7月，GSK开始资助Wilson实验室全力开发新一代更安全的基因疗法，GSK在9年内为Wilson提供2940万美元，但附带条件：这家大型制药公司拥有用钱赚钱的发现权。
威尔逊的实验室没过多久就取得了进展。该小组尝试使用腺相关病毒(AAVs)作为腺病毒的替代品。
1965年，AAV首次被发现为腺病毒样本的污染物。但许多病毒学家认为研究它们是浪费时间，因为它们不会引发任何疾病，而这一事实后来成为基因治疗的最大资产(使其不太可能引起极端的免疫反应)。在当时过去的35年里，科学家们只发现了六种AAV变体，尽管它们看起来很安全，但没有一种特别擅长递送基因。
▲ rAAV转导通路（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）
2001年7月，也就是GSK的资金首次到位的一年后，高光坪开始利用聚合酶链反应(PCR)技术从猴子组织中提取病毒DNA片段，寻找新的AAVs。当他在12月中旬的一次实验室会议上首次展示这些数据时，威尔逊持怀疑态度。但当天经反复确定，威尔逊最终承认，“光坪，我想你踩到了金矿，”高回忆道。
威尔逊请另一位科学家重复实验。2002年春季的一个星期六，当研究结果保持稳定时，威尔逊召集了研究小组对结果进行了评估。当天下午，研究小组开始意识到他们偶然发现了一个全新的、高度多样化的AAV家族——超过100个。但它们会比现有的6个更好吗?
在接下来的一年里，高和他的团队一直在狂热地尝试理解和测试新型的AAVs。他们的第一项研究只分离出了AAV衣壳序列的片段，他们仍然需要分离出完整的序列，将它们转化为可用的病毒，然后在动物身上进行测试。他们挑选的前两种病毒分别被命名为AAV7和AAV8，它们将基因导入细胞的能力是之前所知的六种病毒的10-100倍。该团队在2003年发现的一种名为AAV9的病毒似乎更好。
威尔逊急切地想把这种新病毒交到其他研究人员手中，他们可以独立地证明这些病毒已经达到标准，但他遇到了一个障碍。GSK拥有这些病毒的所有权，而这家制药公司对分享这些病毒不感兴趣。该公司不希望其他公司基于这项技术申请专利；更重要的是，GSK担心，草率的实验将使患者乃至整个领域处于危险之中。
威尔逊对此非常愤怒，他认为，学者有义务分享他们的原始资料，所有想使用AAVs的人都可以对它们进行反向工程。最终，GSK让宾大根据材料转让协议向学术界分发AAV。
AAV：令人兴奋的发现
在接下来的几年里，宾大的病毒载体中心成为了AAV的亚马逊。在那里，科学家们每年生产出成千上万的AAV初始材料，用于内部使用并分发给其他人。
其他研究人员利用共享的AAV在接下来的十年内做出了一些最令人兴奋的发现。例如，俄亥俄州全国儿童医院的一个研究小组发现，AAV9能够穿过血脑屏障，而血脑屏障通常是阻止药物和病毒进入的屏障。圣犹达儿童研究医院和伦敦大学学院的一个研究小组利用AAV8开发了一种治疗B型血友病的实验性基因疗法。
随着越来越多的研究小组开始使用威尔逊的病毒，很明显，他们希望获得商业许可来开发真正的基因疗法。GSK还是不肯让步。经过一年多的谈判，该公司终于在2009年3月就威尔逊AAVs的使用权达成了协议，并将其安置在一家后来更名为Regenxbio的新公司。该公司的文件清楚地表明了它的目的：将威尔逊的技术商业化。
2015年9月17日，杰西去世16周年纪念日，Regenxbio在纳斯达克上市。
▲ Regenxbio首席执行官肯·米尔斯(中)和詹姆斯·威尔逊(左中)庆祝他们的基因治疗公司Regenxbio首次公开募股（图片来源：Nasdaq）
2013年，他的实验室推出了几个项目，其中包括治疗杰西·盖辛格的OTC缺乏症，这是Regenxbio衍生公司Dimension Therapeutics的基础。一年后，Regenxbio增加了对威尔逊实验室的资助。该公司希望启动自己的临床项目，而不仅仅是向其他人提供AAV。
经过多年相对孤立的经营，威尔逊开始与制药公司合作，合作伙伴包括Biogen、强生、Moderna和Precision BioSciences，他们的项目涵盖了从阿尔茨海默氏症等常见疾病到OTC缺乏症等罕见疾病的各个领域。威尔逊的年度预算从GSK时期的数百万美元飙升至如今惊人的7000万美元。
2014年5月，俄亥俄州全国儿童医院的神经科医生给一名患有脊髓性肌萎缩症(SMA)的婴儿注射了AAV9病毒(约67万亿病毒/每千克体重)，剂量是15年前杀死杰西的腺病毒剂量的100多倍。注射后不久，该婴儿似乎一切正常，但几周后，经历肝酶水平飙升。幸运的是，强的松能有效抑制这种炎症。强的松是一种类固醇，现在正广泛地应用于接受基因治疗的患者。2017年11月，这项有15名患者参与的研究结果显示，所有婴儿在20个月大时仍然存活。有些人甚至能坐、能说、能走，基因疗法挽救了他们的生命。
迄今为止，已有三种载体化的AAV血清型获得了用于患者商业用途的监管批准：AAV1(Glybera; uniQure)和AAV2(Luxturna; Spark Therapeutics)、AAV9(Zolgensma; 诺华/AveXis)。目前在临床试验中使用的AAV载体少于12种血清型，其中使用频率最高的是AAV2。值得注意的是，更新和更有效的衣壳，如AAV8、AAV9和AAVrh.10正在用于越来越多的试验。
挑战仍然存在
基因治疗领域重新点燃的兴奋再次唤起了人们对过去的担忧。有些人仍担心历史会重演。“我一直都做噩梦，”高光坪教授说。“我非常害怕，这个领域的行动太快了，人们可能不够小心，而像Jesse Gelsinger这样的事情会再次发生。”
该领域的核心仍然在很大程度上依赖于基因递送系统。无论是在体(in vivo)还是离体(ex vivo)基因治疗，其第一步都是将治疗性转基因/基因编辑工具包装进递送载体，然后通过扩增宿主细胞系，以达到足够高的载体浓度。
基于安全性和治疗性基因容量问题，非病毒递送方法变得越来越普遍。最简单的非病毒基因传递系统如裸DNA、质粒DNA，当直接注射到某些组织，特别是肌肉时，可以产生显著水平的基因表达，但仍然低于用病毒载体实现的基因表达。
目前，病毒载体仍然是基因治疗试验最流行的递送方法，迄今为止，已用于大约三分之二的试验。根据一项2017年的统计，腺病毒是最常用的载体，占所有试验的20.5％，但自2012年(23.3％)以来有所下降。近年来，逆转录病毒载体使用率同样下降(只占试验的17.4％，而2012年为19.7％，2007年为22.8％，2004年为28％)，这很大程度上是由于慢病毒载体(约为7.3％，比2012年的2.9％增加)的出现，提高了安全性以及扩大了使用范围。类似的趋势发生在腺相关病毒(AAV)的使用情况，从2012年的4.9％增加到2017年的7.6％。
药物产品的可负担性已经成为了基于病毒的基因疗法的主要障碍之一。根据美国知名处方药比价网站GoodRx发布的2019年全球最昂贵药物榜单，两款AAV基因疗法占据了前两名，分别是212.5万美元的Zolgensma和 85万美元的Luxturna。今年6月，欧盟批准了Bluebird bio针对重型β地中海贫血的基因疗法Zynteglo(LentiGlobin)，其使用慢病毒载体转导CD34+细胞，177万美元的定价使其成为目前全球第二昂贵的药物。
价格主要归因于制造的高成本。要想生产足够的载体用于治疗，需要大量的资源和专业知识以及合适的生产系统。
治疗所需的高剂量也带来了人们对安全性的担忧。
2018年2月，威尔逊发表了一项小型研究，表明高剂量类似AAV9的病毒对猴子和猪造成了严重的毒性，以至于这些动物不得不被安乐死。在此两周前，他还悄然辞去了Solid Biosciences科学顾问委员会的职务。Solid Biosciences是一家使用高剂量AAV9治疗肌肉萎缩症的公司。
威尔逊承认，科学家们仍然不完全理解为什么AAV在一定剂量下会变得有毒，但很明显，如果没有更有效的基因递送工具，高剂量的AAV可能是纠正某些疾病的唯一方法，尤其是肌肉疾病。高剂量还造成了额外的制造障碍和高成本。
这些担忧指导了威尔逊的新公司Passage Bio的战略，该公司专注于研究罕见的遗传神经疾病。该公司临时首席执行官奥比米德•斯奎托(OrbiMed's Squinto)表示：“我们一直在努力选择需要非常、非常低剂量治疗的疾病。”该公司还计划将AAVs直接注射到脑脊液中，这应该比Zolgensma使用的全身注射需要更小的剂量。斯奎托说：“威尔逊在他的职业生涯中不会再冒太多的风险了。在进行人体实验之前，我们将尽可能地了解更多。”
免疫障碍同样存在于当前基因疗法的开发过程中。例如，重组AAV蛋白衣壳、其基因组和转基因的蛋白质产物可以在多个阶段与宿主免疫系统相互作用，对有效基因递送和持久基因表达构成障碍。目前，中和抗体(Nab)筛查和排除血清反应阳性受试者仍然是许多临床研究中的必要步骤。
基因疗法代表了治愈人类疾病的前沿之一，基因递送载体的革新极大地推动了该领域的发展。挑战仍然存在，使命还远未达成！
专家点评
以十年为一个周期，基因治疗从90年代的火热，到新世纪前十年的逐渐冷却，转折点就是威尔逊发起的临床研究中，严重副反应造成杰西去世。在潮水退去的十年，威尔逊潜心实验室改造AAV，为2010年以后基因治疗的迅猛地展奠定了其实的基础。在这个特殊的日子，我们要感谢威尔逊教授，也更要感谢为医疗技术发展付出生命的志愿者。
Wilson博士是基因治疗领域的先驱和领导者，在30多年的年轻的基因治疗研究领域里，他取得了许多开创性的发现，并在该领域所经历的无论是低谷时期，还是在复兴热潮时期，他都发挥了关键的并且是基因治疗的基石的作用。他的开创性研究产生了许多突破性的科学发现，这些发现是目前许多基因治疗项目取得成功的基础，包括发现和开发腺相关病毒载体（AAV）。目前，他实验室中改善大脑交付的努力得到了一些制药和生物技术合作伙伴的大力资助，并通过与这些公司的专家科学家合作得到支持。
在第一波基因治疗中，用复制缺陷逆转录病毒作为基因传递载体。但很快就产生了有关副作用的担忧，包括对载体的炎症反应，以及可能存在的基因毒性。尽管在早期研究中经历了挫折，科学家在病毒学、免疫学和其他相关领域继续努力工作，改进载体，克服技术障碍。在2000年代，改造的腺相关病毒 （AAV）作为一种安全和高效的基因传递载体，触发第二波临床活动。
随着技术的发展，基因编辑技术也开始活跃在如今的基因治疗领域。ZFNs, TALEN, CRISPR/Cas, 单碱基编辑等技术可以精准高效地编辑基因组，靶向致病基因；也可以跟免疫学技术结合治疗肿瘤等。虽然新型基因编辑技术比传统的过表达技术更为高效精准并扩大了应用范围，但其应用于临床治疗的安全性还有待验证。降低甚至消除基因编辑和碱基编辑的脱靶效应以及更加安全（低免疫排斥）且高效率的递送载体等是目前科学家们在积极探索和解决的方向。我们相信在不久的将来，随着基因治疗技术以及载体的不断扩展和多学科交叉应用，基因治疗技术可以安全有效得应用于罕见遗传病的治疗，并推进至常见病治疗领域，最终实现技术革命和巨大社会价值。
附：威尔逊相关经历时间轴
1993年3月
1999年9月17日
2000年1月
2000年7月
2002年4月
2002年8月
2003年10月
2004年6月
2005年2月
2009年3月
2010年2月
2014年5月
2017年11月
2018年1月
2018年2月
2019年2月
2019年5月24日
2019年5月29日
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